荧光定量PCR联合ELISA检测丙型肝炎病毒的临床应用研究

1、荧光定量PCR联合ELISA检测丙型肝炎病毒的临床应用研究    我国一般人群抗-HCV阳性率为3.21，急性丙型肝炎绝大多数都将形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因2。目前，医院和血站大多采用ELISA法检测血清中抗-HCV来诊断可疑感染者和筛选献血员。     作者：高英英，马雷，孙玉鸿    作者单位：佳木斯大学临床医学院检验系，黑龙江 佳木斯 154003；佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154003   【摘要】  目的：

2、探讨荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）联合检测丙型肝炎病毒的临床意义。方法：用FQ-PCR联合ELISA方法检测117例临床已确诊为丙型肝炎患者的血清，同时检测它们的丙氨酸氨基转移酶（AAT）。结果：抗-HCV阳性率随着HCV-RNA含量的升高而增高，其阳性率与HCV-RNA含量呈正相关。87例HCV-RNA阳性标本中，有50例ALT异常，其异常率随着HCV-RNA含量的升高而增高，ALT异常率与HCV-RNA含量呈正相关， ALT水平和HCV-RNA含量之间呈正相关。FQ-PCR检测敏感性为74.4%(87/117)，漏检率为25.6%（30/117）

3、。ELISA法检测敏感性为76.9%（90/117），漏检率为23.1%（27/117）。两种方法联合检测敏感性为92.3%(108/117)，漏检率为7.7%（9/117）。结论：两种方法联合检测，互相补充，大大提高了丙型肝炎病毒的检出率，为临床早期，准确诊断丙型病毒肝炎、监测病情、观察疗效提供了有力的依据，为献血人员筛选和血制品安全提供了有力保障。 【关键词】  丙型肝炎病毒核酸；丙型肝炎病毒抗体；荧光定量逆转录聚合酶链反应；酶联免疫吸附试验；丙氨酸氨基转移酶 Detection of hepatitis C virus by FQ-PCR and ELISA: Clinical

4、 application GAO Yingying，MA Lei，SUN Yuhong     1.The Clinical Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;2.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China     Abstract:Objective:To discuss the clinical significance of detectio

5、n of hepatitis C virus by FQ-PCR and ELISA.Methods:We detected of 117 sera of clinical patients who had been diagnosed as hepatitis C,and at the same time tested their alanine aminotransferase(AAT).Results: Anti-HCV's positive rate rose with HCV-RNA content increase. By using correlation analysi

6、s,anti-HCV positive rate and  HCV-RNA content showed positive correlation.There were 50 AAT abnormal ones in 87 HCV-RNA positive samples.AAT abnormal rate rose with HCV-RNA content increase,showing positive correlation by using correlation analysis, and  there was a positive correlation be

7、tween the AAT level and HCV-RNA content.FQ-PCR detection sensitivity was 74.4%(87/117),and omission factor was 25.6%（30/117）.ELISA detection sensitivity was 76.9%（90/117）,and omission factor was 23.1%（27/117）.Combined detection sensitivity of two kinds of methods was 92.3%(108/117),and omission fact

8、or was 7.7%（9/117）.Combined detection sensitivity was higher than that of separate.Conclusion:The combined detection  is complementary,and greatly improves the hepatitis C virus detection rate,providing a powerful basis for clinical early and accurate diagnosis of hepatitis C virus,condition mo

9、nitoring,and clinical observation, and providing a strong support for screening blood donors and safety of blood products.     Key words:HCV-RNA；anti-HCV；FQ-PCR；ELISA；AAT 我国一般人群抗-HCV阳性率为3.21，急性丙型肝炎绝大多数都将形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因2。目前，医院和血站大多采用ELISA法检测血清中抗-HCV来诊断可疑感染者和筛选献血员。但ELISA法检测血清抗-H

10、CV敏感性不高，存在30左右的漏检率3,4，耽误了一部分患者疾病的治疗和引起输血后HCV感染的流行。因此，我们用FQ-PCR联合ELISA方法检测117例临床已确诊为丙型肝炎患者的血清，并同时检测血清ALT。探索能够提高丙型肝炎病毒检出率的方法，为临床诊断丙型病毒肝炎，判断病情和疗效提供参考依据。     1  对象和方法     1.1  对象     选取佳木斯大学附属第一医院200601200708门诊和住院患者117例，男67例，女50例，年龄1473岁，平均45.0岁。全部病

11、例均为已确诊慢性丙型肝炎患者，排除其它型肝炎引起肝损伤的患者。诊断严格按照2000年西安中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学会联合修订的病毒性肝炎防治诊断标准。根据HCV-RNA含量(拷贝/mL)将资料分为<1×102、1024、1045、1056和>1065个组。       1.2  方法     1.2.1  血清HCV-RNA定量检测     HCV-RNA的检测采用FQ-PCR，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，核酸扩增仪为美国ABI公

12、司的PE7700型全自动实时荧光定量PCR仪，参考值<1×102拷贝/mL。     1.2.2  抗-HCV检测     抗-HCV检测采用ELISA法，严格按试剂盒说明书操作，试剂盒由沈阳惠民生物工程有限公司提供。     1.2.3  ALT检测     血清ALT检测采用酶动力学法，正常参考值：540U/L(37)，试剂采用日本和光试剂，检测仪器为日本Olympus AU1000全自动生化分析仪。    

13、; 1.2.4  统计学处理     采用SPSS11.0统计软件，计数资料用2检验，计量资料以(x±s)表示，组间比较用t检验，对HCV-RNA含量的对数值与ALT含量进行线性相关关系分析和相关性显著性检验，P<0.05为差异有显著性。     2  结果     2.1  HCV-RNA含量与血清抗-HCV表达     见表1。117例标本经FQ-PCR定量检测，有87例HCV-RNA含量高于1×102拷贝/mL，其

14、中抗-HCV阳性75例，阳性率为86.2%（75/87），而低于1×102拷贝/mL血清标本中，抗-HCV阳性率为50.0%(15/30) ，经相关性分析，两者有明显相关性(2=16.474，P<0.05)。抗-HCV阳性率随着HCV-RNA含量的升高而增高，经相关性分析，其阳性率与HCV-RNA含量呈正相关(r=0.881，P<0.05)。表1  117例标本HCV-RNA含量及抗-HCV检测结果（略） 2.2  HCV-RNA含量与血清ALT含量关系     见表2。从表2中可看出，87例HCV-RNA含量高于1

15、15;102拷贝/m血清标本中，有50例ALT异常，其异常率随着HCV-RNA含量的升高而增高，经相关性分析，ALT异常率与HCV-RNA含量呈正相关(r=0.921，P<0.05)，而ALT水平和HCV-RNA含量之间亦呈正相关(r=0.894，P<0.05)。表2  117例标本HCV-RNA与血清ALT含量关系（略） 2.3  FQ-PCR联合ELISA检测结果     见表3。FQ-PCR检测敏感性为74.4%(87/117)，漏检率为25.6%（30/117）。ELISA法检测敏感性为76.9%（90/117），漏检率为2

16、3.1%（27/117），两种方法检测血清标本敏感性差异无显著性（2=0.208，P>0.05)。两种方法联合检测敏感性为92.3%(108/117)，漏检率为7.7%（9/117）。联合检测敏感性明显高于单独检测 (2=10.636，P<0.05)。表3  各种实验方法检测丙肝病毒敏感性比较（略） 3  讨论     HCV-RNA检测是诊断HCV感染的直接可靠的指标，FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性强、自动化程度高和操作简捷等优点。抗-HCV试剂采用间接酶联免疫法，国内多采用第三代抗-HCV ELISA试剂，它包被的抗原为H

17、CV抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特异性达到99.0%。本研究中HCV-RNA阳性率为74.4%，漏检率为25.6%。有15例标本HCV-RNA阴性，而抗-HCV阳性。这可能与抗-HCV抗体为IgG类抗体，特异性差，维持时间长、患者接受抗病毒治疗后，HCV复制受限、血液中HCV-RNA含量呈阶段性变化、病毒株发生变异等因素有关5,6。抗-HCV阳性率为76.9%，漏检率为23.1%。有18例标本抗-HCV阴性，而HCV-RNA阳性。漏检率高的原因可能是由于部分患者处于感染的早期阶段，机体未产生免疫应答或弱表达，而未产生抗体、或者产生的抗体过少，而检测不到、还可能是病毒株发生了变异等原因。两

18、种方法联合检测阳性率为92.3%，漏检率为7.7%，二者互相补充，大大提高了丙型肝炎病毒的检出率。本实验研究结果显示，抗-HCV指标阳性率随HCV-RNA含量的增高而增高，ALT异常率及平均含量随HCV-RNA含量的增高而增高。对患者血清HCV-RNA含量的对数值与ALT含量进行相关性分析和相关性显著性检验，表明HCV-RNA含量与ALT水平呈正相关。ALT水平升高反映肝细胞破坏程度加剧，ALT下降表示抗病毒的治疗取得疗效，提示HCV-RNA含量与肝功能损伤呈正相关。     综上所述，FQ-PCR和ELISA联合检测为临床早期，准确诊断丙型病毒肝炎、监测病情、观察疗效提供了有力的依据，为献血人员筛选和血制品安全提供了有力保障。 【参考文献】   1中华医学会肝病学分会、传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南J.中华肝脏杂志,2004,12:194198    2Sarra