部分柿品种叶绿体基因组 trnS-trnfM区域的序列变异

1、 部分柿品种叶绿体基因组trn S-trnf M区域的序列变异1胡德昌,张青林,罗正荣*华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室,湖北武汉(430070摘要:应用通用引物扩增10个柿属基因型(包括柿品种9个和近缘种1个叶绿体基因组trn S-trnf M区域,克隆测序得长度为1155bp1160bp的核苷酸序列,包含trn S,psb Z,trn G 和trnf M基因编码序列及其基因间隔区序列。共检测出出17个序列突变位点,包括11个替换,3个插入和3个缺失。供试中国原产柿品种突变位点2个、日本原产柿品种为14个,差异显著。相对古老的柿品种序列保守且高度同源,而近期选育出的阳丰变异水平最高

2、,部分变异位点与母本富有相同。邻接法分析结果表明原产中国的柿种质与日本的分别聚类,推测两者具有不同起源。序列比对和系统发育分析结果均表明中国原产完全涩柿磨盘柿与完全甜柿宝盖甜柿和鄂柿1号起源亲本亲缘关系较近。关键词:柿,君迁子,叶绿体DNA,trn S-trnf M,序列变异1 前言柿(D.kaki Thunb.隶属于柿属植物(Diospyros spp.,是重要的东亚果树。多数柿品种为六倍体(2n=6X=90,但近来发现部分品种为九倍体(2n=9X=135(Zhuang et al., 1990。前人曾采用RAPD(Yamagishi et al., 2005,AFLP(Kanzaki et

3、 al., 2000,SRAP(Guo et al., 2006,IRAP和REMAP(Guo et al., 2006等分子标记进行过总基因组DNA遗传多样性检测和聚类分析,但由于柿核基因组较大且倍性复杂,无法确认其品种间的遗传关系。Yonemori et al.(1996采用PCR-RFLP技术分析了柿属植物叶绿体基因组DNA的扩增片段长度多样性,但未检测到不同柿品种间的差异。Ino et al.(2002进而对cpDNA mat K区域进行过序列分析,也发现供试柿品种完全一致。叶绿体基因组一般为母系遗传,结构和序列比较保守,较核基因组变异频率低。因此, cpDNA分析常被用作植物种上的遗

4、传多样性和系统进化研究(Palmer, 1987; Badenes et al., 1995; Xu et al., 2001 。trn S-trnf M区域位于高等植物叶绿体基因组的大拷贝区(LSC,large single copy regions,包含trn S-UGA (tRNA-Ser,psb Z(ycf9, trn G-GCC(tRNA-Gly和trnf M-CAU四个基因序列编码区域,而基因间隔区(Intergenic spacer,IGS为非编码序列,进化速率较快,可用于探讨植物种间甚至种内不同基因型间的遗传关系(Wu et al., 2005; King et al., 19

5、98。本文分析了10个染色体倍性、分布及果实脱涩性状不同的柿属植物cpDNA trn S-trnf M区域的序列变异,以期为探讨核基因组复杂的多倍体物种的种下遗传关系提供科学依据。2 材料与方法2.1试材试材为柿属10个基因型(表1。其中,君迁子(D. lotus L.1个单株和柿(D. kaki Thunb. 9个品种,包括原产中国的3个甜柿、1个涩柿品种,以及原产日本的3个完全甜柿、1个不1基金项目:国家自然科学基金(No. 30471203和高等学校博士学科点专项科研基金(No.20030504014资助。*通讯作者Author for correspondence ( E-mail:

6、luozhr 完全甜柿和1个不完全涩柿品种。在供试材料中,阳丰为富有×次郎的F1代。所有试材均取自华中农业大学柿圃。2.2DNA提取取鲜嫩叶片57g,参考Doyle等(1987CTAB法提取总DNA。2.3trnS-trnfM 区域PCR扩增与测序引物序列:正向引物(53GAGAGAGAGGGATTCGAACC,反向引物(53 CATAACCTTGAGGTCACGGG(Demesure et al., 1995。反应体系:1×PCR Buffer, 1.5 mM Mg2+, 0.2 mM dNTPs, 0.2 µM primers, 1U Taq DNA poly

7、merase (TaKaRa,Japan,DNA 30 ng,反应体积25 µl,模板DNA 30 ng。扩增程序:94 4 min 1个循环,94 1 min,55 1 min, 72 2 min 35个循环,72 10min 1个循环,4保温。所有DNA扩增反应均在Whatman Biotrate PCR仪上进行。扩增产物通过溴化乙锭(EB染色的2%琼脂糖凝胶电泳检测。SYNGENE凝胶成像系统观察并记录谱带。利用UniQ柱型回收试剂盒(上海生物工程有限公司回收纯化扩增产物,以PMD-18T作载体进行TA克隆,应用质粒电泳和酶切法确定阳性克隆。所得阳性克隆由北京奥科生物技术有限公

8、司在3730型号自动测序仪上进行双向测序。表1 本试验供试的柿属植物基因型及其一般生物学信息Table1 The genotypes, sources and cp DNA trn S-trnf M lengths of the genus Diospyros in this study编号No. 基因型Genotype学名Scientific name倍性Ploidy level脱涩类型Astringent type原产地Source序列长度Length (bp1 君迁子Date plum D. lotus L. 2n=2x=30 - China11552 磨盘柿Mopanshi D.kak

9、i Thunb.2n=6x=90 PCA China 11563 罗田甜柿Luotiantianshi D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PCNA China 11564 宝盖甜柿Baogaitianshi D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PCNA China 11565 鄂柿1号Eshi No.1 D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PCNA China 11566 禅寺丸Zenjimaru D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PVNA Japan 11557 富有Fuyuu D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PCNA Japan 1

10、1578 阳丰Youhou D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PCNA Japan 11609 次郎Jirou D.kaki Thunb. 2n=6x=90 PCNA Japan 115610 平核无Hiratanenashi D.kaki Thunb. 2n=9x=135PV A Japan1156 注:PCNA,完全甜柿;PVNA ,不完全甜柿;PVA ,不完全涩柿;PCA,完全涩柿。Note: PCNA, pollination constant non-astringent; PVNA, pollination variant non-astringent; PVA,pol

11、lination variant astringent; PCA, pollination constant astringent.2.4序列比对和聚类分析以磨盘柿作为对照,应用Clustal X 软件(Thompson et al.,1997对所获的cpDNAtrn S-trnf M 区域序列进行比对,统计供试材料的碱基突变,插入和缺失位点。应用MEGA2 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis软件(Kumar et al., 2001进行邻接法分析(Neighbor- joining Method和构建系统发育树。3结果与分析 3.1柿属植物cp

12、DNA trn S-trnf M区域的通用引物扩增及其序列分析扩增产物电泳检测结果表明君迁子和柿及柿品种间cpDNA trn S-trnf M区域核苷酸序列无明显长度差异(图1。回收扩增片段,克隆测序结果显示cpDNA trn S-trnf M区域包括psb Z 和trn G两个基因编码序列,trn S 和trnf M基因的部分编码序列以及三个基因间隔区。君迁子为1155bp;9个柿品种相应序列长度介于1155 bp1160 bp之间,其中禅寺丸序列最短(1155bp,阳丰序列最长(1160bp(表1。以磨盘柿为例,trn S-trnf M区域A,T,C和G碱基的含量分别为32.96%,29.

13、84%,18.08%和19.12%,A+T含量为62.8%,G+C含量为37.2%。编码区域为391bp,基因间隔区域为765bp。应用BLAST软件与烟草(Nicotiana tabacum, No.Z00044; Shinozaki et al., 1986、柑橘(Citrus sinensis, No.DQ864733; Bausher et al., 2006和葡萄(Vitis vinifera, No.DQ424856; Jansen et al., 2006GenBank中登录序列进行比对,同源性为69%77%,变异主要发生在非编码区域序列。应用Clustal X软件对6个完全甜柿

14、品种,2个不完全甜柿品种和近缘野生种君迁子与磨盘柿叶绿体基因组trn S-trnf M区域序列进行比较,共存在17个突变位点,包括11个替换,3个插入和3个缺失,未发现大片段插入和缺失(表2。在四个编码区域中,仅trn S区域检测到1个碱基变异位点;而非编码区域序列的变化丰富,IGS I,II和III 区域分别发生3个, 6个和7个变异位点。本实验中,中国部分柿品种间存在2个碱基变异位点,未发现插入和缺失;而日本柿品种存在14个突变位点,包括3个插入和2个缺失(表2。结果表明中国和日本的不同品种突变差异显著。中国完全甜柿种质宝盖甜柿和鄂柿1号与涩柿磨盘柿序列完全一致,结果表明宝盖甜柿和鄂柿1号

15、起源母本与涩柿磨盘柿亲缘关系相近。罗田甜柿仅在89bp(T-C和1050bp(C-T两个位点发生核苷酸突变。日本完全甜柿次郎和不完全涩柿平核无在此区域DNA序列完全相同;不完全甜柿禅寺丸在268bp,907bp两个位点发生碱基变异和1063bp 发生单个碱基A缺失;完全甜柿富有只在791bp一个位点发生单个核苷酸A插入;富有×次郎杂交近期选育品种阳丰此区域DNA序列高度变异,共发生13个变异位点包括9个碱基变异和4个核苷酸插入。阳丰与富有在此区域791bp处变异位点相同,均发生单个碱基A的插入,而与父本次郎明显不同,支持cpDNA母系遗传规律。 图1 君迁子和9个柿品种cpDNA t

16、rn S-trnf M区域扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳图谱。编号110如表1。M:DL2000 marker.Fig.1 Amplification products of cpDNA trn S-trnf M region from Date plum and 9 persimmon varieties detected by 2%agorose gel. M:DL2000 marker. 110 refer to the numbers listed in Table 1. 注:a 磨盘柿相应序列长度;b 磨盘柿序列5端起相应位置;c 未检测到变异位点。Note: a Aligned len

17、gth referred to Mpanshis sequence; b Mutation site was denoted the position of Mopanshis sequence from the 5-end; c no mutation was observed in corresponding region.3.2 基于cpDNA trnS-trnfM 区域的序列变异的柿属植物系统发育分析根据trn S-trnf M 区域序列变异位点,应用MAGE 软件邻接法分析,构建系统发育树(图2。君迁子作为柿近缘野生种,形成外类群。在日本甜柿种质中,完全甜柿品种阳丰与母本富有具有共同

18、的变异位点,聚为一组。不完全涩柿平核无和不完全甜柿禅寺丸相聚,然后与完全甜柿次郎相聚,表明不同倍性和脱涩类型的非完全甜柿起源亲本存在较近的亲缘关系,不完全甜柿和不完全涩柿母本均为完全甜柿种质。原产中国的完全甜柿鄂柿1号单独成组。中国原产的两个古老品种-完全甜柿罗田甜柿与完全涩柿磨盘柿聚类,然后与近期发现的中国原产甜柿新种质宝盖甜柿聚为一组,与Guo et al.(2006应用IRAP 和REMAP 分子标记技术分析聚类结果一致。根据树枝长度和分歧时间推断磨盘柿和罗田甜柿起源亲本分化时间与富有和阳丰,以及禅寺丸和平核无一致。在应用邻接法构建系统发育树图中,原产中国柿种质与日本柿种质分别聚类,表明

19、两者具有不同的起源,与我们前期的推论一致(Luo et al., 1999;Guo et al., 2006;Hu et al., 2006。cpDNA 区域cpDNAregions序列长度 Aligned length a (bp 变异位点编号 Mutation number 变异位点 Mutation site b (bp 变异基因型 Genotype 变异类型 Comment trn S91bp 1 89 Luotiantianshi base change from T to C 2138 Youhou base change from C toT 3157 Youhou base c

20、hange from T to C IGS I 352bp 4268 Zenjimaru base change from C to T psb Z 189bp-c - - - 5661 Youhou Insertion A 6 704 Youhou base change from A to C 7 751 D. lotus deletion A8 791 Fuyuu Youhouinsertion A9904 Youhou base change from T to A IGS II 275bp 10907 Zenjimaru base change from A to G trn G 7

21、1bp- - - - 111002 Youhou base change from A to T 121046 Youhou base change from T to C 13 1050 Luotiantianshi base change from C to T14 1054 Youhou deletion C15 1063 Zenjimaru deletion A16 1064 Youhou insertion GGGIGS III 138bp 17 1100 Youhou base change from G to Ttrnf M 40bp - - - -表2 君迁子和9个柿品种cpD

22、NA trn S -trnf M 区域的序列比较Table2 the sequences characterizations of cpDNA trn S-trnf M region in Date plum and 9 persimmon varieties 图2 基于叶绿体基因组trn S-trnf M区域序列变异位点的9个柿品种与近缘野生种君迁子的系统发育树。分枝旁数值为500次自展检验所获得自展值。Fig.2 Phylogenetic tree among 9 persimmon varieties and related species D. lotus based on the m

23、utation sites in cpDNA trn S-trnf M regions using MAGE Neighbor-Joining method. Numbers next to the branches indicate thebootstrap values of 500 replicates.4讨论应用RFLP(Nakamura et al., 1994和PCR-RFLP(Yonemori et al., 1996分子标记进行遗传多样性研究结果表明,柿叶绿体基因组检测位点变异程度较低,而mat K区域测序结果显示三个供试柿品种cpDNA序列相同(Ino et al., 200

24、2。在其他物种中,cpDNA trn S-trnf M区域酶切位点种内材料呈现多态性表明此区域序列存在丰富变异(Wu et al., 2005; King et al., 1998。本实验对9个柿品种cpDNA trn S-trnf M区域特异扩增并克隆测序,序列比对结果表明部分柿品种存在多个碱基突变,插入和缺失位点。相对于限制性内切酶酶切技术,cpDNA相应区域扩增片段测序得到的变异位点信息更为丰富有效。君迁子(2n=2X=30染色体数目与柿(2n=6X, 9X=90, 135差异显著,但与磨盘柿相应区域序列比较仅存在一个位点变异,表明两者起源亲本关系较近,与染色体原位杂交技术(Chio e

25、t al., 2003b,Ty1-copia反转录转座子(Nakasuka et al., 2002,SRAP(Guo et al., 2006a分析结果一致,支持Yonemori et al.(1998基于cpDNA PCR-RFLP分析结果中关于柿与君迁子有共同起源亲本的推论。供试材料中,原产中国柿品种磨盘柿(公元1116年记载和罗田甜柿(公元1034年前记载以及日本品种禅寺丸(1214年发现、富有(1844年发现,次郎(1844年发现均为相对古老的柿品种,在本实验所分析区域的序列同源性较高,表明其起源亲本亲缘关系相近。宝盖甜柿和鄂柿1号为在湖北省大别山区发现的甜柿种质(潘德森等,1994

26、,但与涩柿品种磨盘柿序列相同,邻接法系统发育分析结果也表明两者亲本与磨盘柿存在较近的亲缘关系,与Guo et al.(2006b应用IRAP和REMAP分子标记聚类结果和Hu et al.(2006线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA分析结果一致。阳丰于1967年由富有×次郎杂交育成,本实验结果显示其与母本存在共同变异位点,支持cpDNA母系遗传方式。日本原产柿种质间自然杂交和人工选择频繁,可能是其比中国原产柿种质变异频率较高的原因。缺乏完整序列信息是叶绿体基因组应用于作物育种研究主要障碍。迄今,已有23个高等植物种类包括柑桔、葡萄等园艺植物的叶绿体基因组测序

27、完成,而柿属植物中的相关研究相对滞后。由于胞质基因组,包括cpDNA和mtDNA,在物种起源及亲缘关系研究中具有明显优 势，非编码区域序列分析将为柿品种起源研究和品种亲缘关系分析提供准确可靠、丰富有效 的遗传位点信息。 参考文献 1 Badenes, M. L., Parfitt, D. E., 1995. Phylogenetic relationships of the cultivated Prunus species from an analysis of chloroplast DNA variation. Theor. Appl.Genet. 90, 1035-1041. 2 Ba

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