酶催化甘油三酸脂修饰化合己酸和丁酸产生低热量结构脂

1、酶催化甘油三酸脂修饰：化合己酸和丁酸产生低热量结构脂类摘要：甘油三酸脂的脂肪酶催化酸解产物与己酸和丁酸一起作用生成热量减少结构脂类（sl），sl是通过按甘油三酸脂，丙酸、丁酸、分子比例为1：4：4比率，分别再在1.5ml己烷中加入10脂肪酶（按总底物的质量比），55培养24小时获得可获得。通过九种商用脂肪酶的筛选，一种来自米赫根毛霉的含有脂肪酶的IM60是最有效的，它能产生13mol。不反应甘油三酸脂，49的二取代赫38的单取代三酰基甘油，这种三酰基甘油含有短键脂肪酸。产物用含有蒸气光散射检测器的反相高效液相（HPLC）进行分析。反应条件研究包括：反应时间、温度、酶加载量和底物分子比率。产物的

2、获得证明一种含有长链和短链脂肪酸结构的脂类可以IM60酯化酶在有机介质中合成。关键词：酸解、酶催化合成、脂肪酶、有机溶剂、低热脂肪米赫根毛霉、结构脂类、甘油三酸脂。SL都是三酰基甘油酸（TGA），TGA是由短链或中链脂肪酸（或两都有）和长链脂肪酸与同一甘油分子酯化的混合物（1），由于这些脂类可用于特别疾病的目标性及代谢条件，所以它们能够加强人们的营养。这些脂类亦可用于减少了的热量或低热量的脂肪。这些脂肪在西方世界有很高的需求。短链脂肪酸（SCFA）和中链脂肪酸能为婴儿和重体力劳动成人提供一种快速的能量来源（2），SCFA具有挥发性，能快速地被吸收比MCFA在胃中能更快地被吸收，这是由于SCFA

3、有更高的水溶性，更小的分子体积和更短的链长。它可以作为胃粘膜细胞的良好能量来源。（3）LCFA的吸收是通过淋巴系统，并需要以乳糜微粒的形式来运输，与LCFA不同，SCFA自由地散布在粘性细胞溶质中，并保持自由于脂肪酸的形式进入静脉血管（5）。每单位中的SCFA比MCFA或LCFA提供更少的能量提供即丁酸每克含6卡的热量及丁酸约为每克含7卡热量，相应LCFA每克含有9卡热量。这是用SCFA来生产减少了热量SL的基础。这种合并SCFA和LCFA产生减少了热量的SL的原理已被Nabiso食品公司用于化学合成Salatrim®。这是一种减少了热量的脂肪，这种由丙酸、丁酸和硬脂酸组成的脂肪在食

4、品工业中有非常有用的应用（7）在哺乳动物中，SCFA通常是以自由脂肪的形式出现在胃肠道中，并以碳水化合物作为微生物消化的最终产物出现（8）。在牛奶中的TGA是通过胃脂肪酶的作用来释放出了丁酸盐和己酸盐（8），中链和短链脂肪酸占食用摄入脂肪总量的3（9）。对富油酸食物的研究表明，即使是LCFA、油酸能确切减少总胆固醇和低密度脂蛋白（LDL）的水平。它同样能减少低密度脂蛋白占高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的比率。（10）近年来，研究集中在用脂肪酶在有机溶剂中对TAG进行（结构）修饰。由于副产物较少及通过酶催化过程使反应条件更温和，所以这种方法比化学过程的方法更能引起人们的关注。另外脂肪酶能在TAG特

5、定的位置对特定脂肪酸的催化合并（l）。这种作用被认为是在消化过程中是至关重要的，这是因为在一些TAG的Sn-2位置可以让脂肪酸的吸收被加强（11）。这篇文章的主要内容是用油酸三甘油脂、丁酸、己酸在脂肪酶的生物催化作用下生成一种减少了热量，具有提高营养潜在价值的SL。材料和方法材料：丁酸、己酸和油酸三甘油酯从Sigma化学公司（St.Louis,MO）获得。由Amano酶公司（Troy.VA）友好提供的脂肪酶G是来自于圆弧青霉菌。PS来自多刺假单胞菌，L来自N来自于黑色霉菌，AK来自于多刺假单胞菌及AY30来自皱褶念珠菌。取自于米赫根霉菌的伴有固化脂肪酶的IM60赫IM20是从Novo Nord

6、isk生物化学北美协会（Franklinton.NC）获得。猪胰弹性蛋白酶和1，3二硬脂酸2油酰甘油是从Sigma购买的应用的所有溶剂达到高效液相的纯度要求。这些溶剂购买自Fisher Scientific (Norcross,GA)。酶基转移反应：SL的合成是将旋转转盖式试管以200转/秒转速在旋环振动水浴中及55条件下反应24小时，在事先经过4ºA的分子筛进行干燥的1.5ml的己烷中，反应混合物包括具有代表的50mg油酸三甘油酯，26mg己酸，20mg丁酸和9.6mg酯化酶（例如10总底物质量比）。所有的反应成对进行。提取及分离方法：反应产物用硫酸钠柱冷却和过滤以除去水蒸气和酶颗

7、粒。产物用装有Sedex45型蒸气散光检测仪的（Richard .Scientific.Novato,CA）Hewlett-Packard1099HPLC(Avondale)来分析。ELSO设定在40，氮气喷雾器的压力为2.1atmospheres及放大5倍的非水反相体系。Hewlett-Packard35900数字A/D模拟接口将ELSO连接到在线计算机。各种TAG通过装有Beck/Altex (San Ramon,CA)Ultrasphere ODS 5×25cm) 柱子的非水反相色谱进行分离流动相中包含有乙腈（A）和丙酮（B）的梯度线如下：初始条件（A/B）60：40，以1.3

8、ml/min的流率保持4分钟，然后，30：70（A/B）以1.5ml/min的流率保持8.5分钟，50：50（A/B）以1.5ml/min的流率保持55min然后返回到60：40（A/B）,流率1.3ml/min的状态（三）癸酸甘油酯是依照国际标准。产物鉴定基于极性等同于碳数的原理和应用过去极导的TAG标准（12）为了鉴别在TAG2位上的脂肪酸种类、样品按标准点在薄层色谱板上（TLC）并用石油腊、乙醚、醋酸（体积比为：90：10：1）混合溶剂展开。薄层板喷洒0.2%2、7二氯荧光黄、甲醚溶液后在紫外灯观察TAG谱带。刮下、溶解TAG谱带，并用乙醚洗脱。胰脂肪酶的分析依照Luddy et al(

9、13)所介绍配方法进行。胰脂肪酶水解后，用乙醚提取产物、过滤、用无水硫酸钠干燥。产物用硅胶TLG在乙烷、乙醚、醋酸（50：50：1）为展开剂展开、分离。刮下sn2单酰基甘油（MAG）,并在75下6HCI丙醇溶液中丙基化2小时。用己烷和0.1MKCL溶液提取丙基酯类物质。为了建立针对sn2位置分析的胰蛋白酶水解的准确方法。除标准不溶解在1.5己烷中进行先前的水解外，一种已知结构的标准TAG（1、3-二硬脂酸-2-油酰甘油）用相似的方法进行了分析，这由于标准物不能溶解在检测缓冲液中。脂肪酸的的MAG谱带组成鉴定是由一个装有FID并以无分流形式操作的Packard5890气相色谱来完成的。载气为氦，

10、总气流率为23ml/min。烘箱温度从70开始，并保持4分钟，然后按10/min调到210，再保持等温十分钟。十七烷酸为内标物，脂肪酸丙基脂的摩尔百分比通过一个在线的计算机进行分析和综合。结果与讨论脂肪酶的筛选：通过潜在的7.3mg的脂肪酶同分子比率为1：2：2的油酸三甘油酯、丁酸、己酸在55下，反应24小时的方法来筛选，不同来源的9种商业用脂肪酶。被筛的酶是脂肪酶G. PS. L. N. AK. AY-30(Amano酶公司)。IM20、IM60和SP435（Novo Nordisk生物化学北美组织）。在有限的范围内IM20、IM60 SP435及脂肪酶AP将短键脂肪酸并入了油酸三甘油酯中。

11、来自圆弧青霉菌的脂肪酶G显示出能将LCFA酸加到丙三醇中生成MAG，但我们发现将乙酸和己酸加入到油酸三甘油酯的效率不高。来自于米赫根毛酶菌的IM60生成32的二取代（SLS）。45单取代（LLS）TAG。由于IM60在上述条件下有相对活跃，特别是在TAG的Sn-1及Sn-3位，故其在本次研究被进一步应用。分子比率：甘油三油酸酯、己酸、丁酸的分子比率分别从1:1:1变到1:12:12（见图一）的多种不同变化来研究底物的分子比率变化。酶的数量一直保持在7.3mg而不是保持在底物总量的10。SL的摩尔百分比随分子比率增加而增加。至到分子比率达到1:4:4。在分子比率为1：4：4时得到49SL和38L

12、LS结构的TAG。水解作用在此反应中显得并不重要，在这个水平（小规模）检测中少于5二乙酰基甘油被检测到。所有产物的量是由SL形式及没有反应的甘油三油酸来决定的。这种分子比率被用于余下的反应中，超过1:4:4，没有反应的甘油三油酸脂的量在增加。Nishi和kamimura研究表示SCFA（C2-C6）使P. fragi22.39B。脂肪酶失活。在我们的反应媒介中增机己酸和丁酸同样可以使酶钝化。这可相同于脂肪酶在微量水环境中的酸化作用。温度的影响：适当的温度控制酶催化反应测定的重现性十分重要。温度改变能影响某些参数，如酶的稳定性，酶与底物的亲和力，反应的竞争优势（17）。研究了温度对甘油三甘油酸酯

13、与丁酸和己酸的脂交换的影响。分子比率、培养时间和溶剂分别保持为1:4:4（甘油三油酸脂）、24小时、1.5ml己烷。反应温度从250变化到55。我们发现55为最佳反应温度在55下，12.4%LLL没有反应，生成了44LLS和43。SLS的TAG，随着温度的增加，生成更多二取代TAG，但超过55时，则开始减少（Fig2）.反应时间，反应时间研究（图3）显示随着培养时间的增加化合的己酸和丁酸稳定增加，但经过48小时培养和开始下降。在24小时后SLSTAG的摩尔百分比增至40，48小时培养后仅有一个较少量的增加（15）。这种结果表明在前24小时比后24小时结合更快，随着在反应混合物中LLS的浓度下降

14、，二取代TAG的浓度在增加。由这次研究的目的决定，在余下的实验中选择24小时为反应时间。酶的加载：在我们实验以前的研究表明，占重量10的脂肪酶适合于催化合成一种含有油酸和己酸的SL（12）图4显示，SL的增加随着酶的增加而增加，直到酶占反应物的质量浓度达到10。此后SL不再有明显的增加。这表明包含10酯肪酶是适合这次研究的。反应媒介：当脂肪酶溶解在有机溶剂中，它表现出许多新颖的特质。如改变立体选择性、稳定性增强和改变催化模式（18），溶解在有机溶剂中的化合物成为脂肪酶的潜在底物（18），以前有报道说：有机溶剂与酶水合物的反应控制着酶的活性，并且酶水合物的物理裂解导致了酶的失活（19）。非极性溶剂，例如：甲苯和己烷，它们容纳不了大量的水，因此不能从酶中获得大量的水（20）。我们发现，非极性溶剂（如己烷、异辛烷）能够比极性溶剂（如丙酮、乙腈）更高产量的SL，己烷和异辛烷做溶剂取代TAG的产量分别为49和53（表1）。用石油指作溶剂未反应的LLL的量与用己烷和异辛烷作溶剂的未反应LLL量相差不大，在石油脂中二取代TAG为32。胰脂肪酶研究：来自于米赫根毛酶菌的IM60优先水解TAG的Sn-1及Sn-3位置上的脂肪酶。当TAG对营养有益时这种就能充分满足需求，这大部分是因为特定的油拥