黄酮类化合物及提取工艺与分析方法(郭彭靖)

1、.黄酮类化合物的提取工艺与分析方法作者，单位中英文摘要，关键词黄酮类化合物（flavonoids），又称生物类黄酮（bioflavonoids），是指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，是多酚类化合物中最大的一个亚类。其基本骨架具有C6-C3-C6的特点，即由2个芳香环A和B，通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物。根据间三碳链的氧化程度、B环（苯基）连接位置（2-或3-位）以及三碳链是否呈环状等特点，黄酮类化合物分为许多不同类型，如黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查尔酮等（叶文峰，2000）。自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，在银杏叶、山楂、杜仲、山香圆叶、

2、水芹、竹叶、黄芪、丹参等植物中均有检出。到目前为止，已经发现有5000多种植物中含有黄酮类和异黄酮类化合物（蔡健等，2003）。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，通过血脑屏障，进入脂肪组织，具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗过敏、抗菌、抗病毒等生理功能（李楠等，2005）。许多应用研究表明，黄酮类化合物具有预防心血管疾病、防癌抗癌、防止骨质疏松和改善动物生长及降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用。例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩；杜鹃素具有止咳祛痰作用；黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用；水飞蓟素具有保肝作用等（肖常厚，1997）。此外，黄酮类

3、化合物也是重要的功能食品添加剂、天然抗氧化剂、天然色素、天然甜味剂（王晶等，2006）。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得。主要是作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用。例如茶多酚在功能食品中的应用主要是以茶叶及其提取物的形式添加到食品中。茶多酚具有抗疲劳、抗辐射、抗衰老等功能特性，茶叶具有独特的色、香、味、形，能使食品增香、调味、着色，因此茶多酚以茶叶的形式在食品中的应用十分广泛。近年来科学家都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步将其加工成有特异功能的保健食品和药品等产品。正是黄酮类化合物上述生物活性和药理作用引起了人们的广泛重视，对该类化合物的

4、研究已成为国内外医药界研究的热门课题。黄酮类物质已成为一类具有广泛开发前景的天然药物（李莉等，2006）。1.黄酮类化合物的主要提取工艺1.1有机溶剂萃取法利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同的溶剂萃取可达到精制纯化目的。唐津忠等（2003）采用正交实验法确定了金莲花中总黄酮提取的最佳方案，通过对提取溶剂、提取固液比、提取时间和提取温度四因素三水平的正交实验，得出最佳提取条件。周才琼（2003）采用由低极性到高极性的系统溶剂提取法浸提金银花花叶，通过纸斑反应，紫外灯观察颜色并用荧光检测，试验表明，金银花及叶中的黄酮类种类相似，但叶中黄酮类含量大大高于花中的含量，金银花叶中的黄酮类化合

5、物最佳提取工艺为：90%乙醇、物料比1:12、70温度下浸提60 min。1.2超声提取法超声提取法是利用超声波产生的强烈振动、空化、粉碎等作用，将植物药材中的成分提取到溶剂之中。超声波是一种强的弹性波，其振动能产生强大的能量，给媒质质点以很大的速度和加速度，从而快速穿透植物体，使溶剂能和植物中的有效成分充分接触，因此有利于有效成分向提取溶剂转移，提高提取效率。近年来超声提取在中药研究中有较多应用。超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出。裴凌鹏等（2003）采用超声波方法从葛根中提取总黄酮，用正交法确定了超声波方法提取总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%、超声波提取25

6、min、提取次数3次、温度25。1.3 碱性水提法黄酮苷类有一定极性，溶于水，易溶于碱性水，难溶于酸性水，故可用碱性水进行提取，再将碱性提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。王永宁等（2003）采用了碱性水提取和乙醇提取两种不同的方法，对槐花中的黄酮类化合物进行提取研究后发现，碱性水提取法的提取率比乙醇提取法的提取率高。1.4 微波法微波法利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使内分子间相互碰撞、挤压利于有效成分的浸出，具有反应高效性和强选择性等特点。龚盛昭等（2003）以石灰水为介质，进行了微波场协同提取芦丁的研究，得到了微波场协同提取芦丁的最佳工艺条件为：m（水）/m（槐米

7、）=16、时间 10 min、微波功率 296 W、提取 2 次。微波协同提取芦丁比传统水提法有提取时间短、产率高等优点。1.5 超临界萃取法超临界CO2萃取技术以液态CO2为溶剂进行提取，提取率与提取温度、提取压力、CO2消耗量等因素有关。陈从贵等（2002）研究探讨超临界CO2提取分离银杏叶药用成分的适用性和可操作性，提出溶剂浸提与超临界流体萃取相结合的生产工艺，既可降低生产成本、保证产品质量，又可大幅度削减设备造价，为超临界流体萃取技术的实际应用创造条件。2.黄酮类化合物的主要分析方法2.1紫外分光光度法紫外分光光度法（UV）定量测定黄酮类化合物的原理是根据黄酮类物质与铝离子形成稳定的络

8、合物，并产生特征吸收光谱。多采用硝酸铝比色法，黄酮类化合物与Al(NO3)3进行络合显色，以芦丁为标准溶液，在510 nm处测定其含量。2.2 荧光光度法根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合物，可采用荧光光度法测定总黄酮的含量，该法操作简便、成本低、准确度较高。张敏等（2005）用体积分数60%乙醇加热回流提取银杏叶有效成分，以芦丁为标样，采用荧光分光光度法，选择激发波长ex= 436 nm，发射波长em= 483 nm，测定银杏叶中总黄酮含量。张仁学等（2005）用体积分数80%乙醇加热回流提取三月泡叶中总黄酮，以芦丁为标样，选择为40 nm，采用同步荧光光度扫描测定了三月泡叶中总黄

9、酮含量。2.3 高效液相色谱（HPLC）法高效液相色谱法分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，适于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析，是测定黄酮类化合物的有效方法。该法可直接分析黄酮苷的含量，也可通过水解后分析黄酮苷元含量，再通过转化系数求得黄酮总含量（赵晓莉等，2005）。胡芳弟等（2003）采用KromasilODS-1色谱柱，甲醇/水为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长254 nm测定了黄氏中黄酮类成分的含量。2.4 薄层色谱法薄层色谱法有许多优点，如固定相一次性使用，样品预处理简单，对分离物质的性质无特别限制，应用广泛，测试速度快，所

10、需溶剂量少，选择范围宽，在同一色谱板上可根据组分性质选择不同显色剂或检测方法进行分离和定性或定量。但在分辨率及重现性等方面不如高效液相色谱法和气相色谱法，一般用作定性和半定量的手段（赵晓莉等，2005）。李钧敏等（2004）利用聚酰胺薄层层析法对云锦杜鹃不同营养器官中黄酮类化合物的成分进行分析，结果表明，云锦杜鹃叶片总黄酮主要含有8种不同的黄酮成分，而根茎中只含有4种不同成分。2.5 高效毛细管电泳（HPCE）法高效毛细管电泳以其高效快速、分辨率高、检测方便、进样量少、分离模式多等特点得到广泛应用（赵晓莉等，2005）。以其电泳迁移技术的差异可分为：毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱

11、（MECC）、毛细管等速电泳（CITP）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管等电聚焦（CIEF）5种类型。在黄酮类化合物的分析中，常用的是CZE和MECC。Marek Urbanek等（2002）采用CITP和CZE在线联用法分离并测定金丝桃类植物的叶或花的甲醇提取物中的芦丁、异栎素、栎素等黄酮类化合物。邓永智等（2003）利用MECC法将中药银杏浸膏中槲皮素、山萘素、异鼠李素3种黄酮进行了分离。2.6 超临界流体色谱（SFC）法超临界流体色谱作为一种新型的分离测定技术已成功用于多种化合物的分析，它综合了HPLC和气相色谱的优点。刘志敏等（1999）利用超临界色谱成功地分离测定了银杏叶提取物水解

12、后的3个苷元槲皮素、山奈酚、异鼠李素的含量，实现了各苷元的定性及定量分析，利用各甙元的转换因子计算出了银杏叶提取物中的总黄酮含量。2.7 色谱-质谱联用法色谱-质谱联用是以色谱作为分离手段，质谱作为检测手段或质谱进一步分离，再进行检测。目前与质谱联用的主要有GC、HPLC等。张淑芬等（2004）利用液相色谱-大气压化学电离化质谱（LC-APCI-MS）联用技术定性分析了3种柑桔果皮中多甲氧基黄酮的主要成分，并结合紫外吸收光谱进一步验证。实验表明，该法在分离分析桔皮多甲氧基黄酮时与HPLC和GC-MS相比，具有一定的优势；而且由于APCI是一种非常有效的软电离方式，对小分子非极性化合物能够得到极强的准分子离子，因而图谱简单干净，易于解析。2.8 其他分析方法除上述分析测定方法之外，也可采用核磁共振法（NMR），红外光谱法等鉴定黄酮类化合物的结构。杨郁等（2005）对黄花石蒜乙醇提取物的乙酸乙酯溶解部分进行分离纯化后得到7个化合物，然后经NMR鉴定了它们的结构。方艳夕等（2006）从杭菊花序的95%乙醇提取物中，分离得到一个黄酮苷类单体化合物，经红外、紫外、核磁共振