新城疫病毒Lasota弱毒株对人肿瘤细胞的体外修饰作用

1、    新城疫病毒Lasota弱毒株对人肿瘤细胞的体外修饰作用【摘要】 目的 研究新城疫病毒(NDV)弱毒株Lasota对体外培养的人肿瘤细胞株免疫功能的影响。方法 以不同病毒滴度作用于肿瘤细胞，采用MTT染色法检测NDV对肿瘤细胞的杀伤作用，同时用NDV处理过的小鼠黑色素B16细胞免疫小鼠，检测其对小鼠NK细胞活性影响。结果 NDV Lasota株对4种癌细胞株均具有较强的杀伤作用，用其处理小鼠黑色素瘤细胞株后，再次接种可提高小鼠体内的NK细胞活性。结论 NDV能够抑制肿瘤细胞生长，诱导其凋亡，免疫接种小鼠后，可提高小鼠的细胞免疫功能。【关键词】 新城

2、疫病毒;肿瘤细胞;生长抑制实验;免疫疗法The Modification Effect of Newcastle Disease Virus Lasota on Human Tumor Cells in VitroJIANG Wenjun,WEI Yang, HU Rui, YAO Wenxiu, TANG Xiaolan, LONG Qiming1.Research Institute of Tumor，Sichuan Cancer Hospital, Chengdu 610041, China，2.Department of Oncology，3.Department of Breast

3、CancerAbstract：Objective To study the effect of newcastle disease virus to the immune response of tumor cells in vitro. Methods Newcastle disease virus lasota is studied in vitro in four carcinoma cells including MCF7、Hela、A549 and HepG2, we also pretreated mice tumor cell with NDV L, then vaccine v

4、irus immunization on mice Balb/C to observe the influence. Results The apparent suppressive effect of NDV on the growth of these four tumor cells was found without does dependence. Pretreated with NDV, the tumor cells can promote the celluar immunity of mice in virto. Conclusion NDV can selective ki

5、ll tumor cells in vitro, NDV pretreated tumor vaccine can decrease the growth of the tumor cell, and have apparent immunostimulatory ability.Key words：Newcastle Disease Virus; Tumor cell; Cell suppression test; Immunotherapy0 引言新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)是常见的禽类副粘液病毒，该病毒对人类的毒副作用极为轻微且很容易灭活，其染色体

6、为螺旋对称的RNA，编码6个基因，全长约15kb。研究表明，NDV能够选择性地杀伤肿瘤细胞，其与肿瘤细胞的结合是特异和不可逆的 1，2。NDV毒株有强弱之分，其不同毒株对肿瘤细胞的杀伤效果不同，Avki等 3将NDV弱致病株用于肿瘤的临床治疗，取得了较好的疗效。本研究选用NDV非溶解性毒株Lasota，用其感染多个人恶性肿瘤细胞株，观察其对肿瘤细胞的体外修饰作用，同时用其处理小鼠黑色素瘤B16细胞株，再免疫小鼠，观察接种后，小鼠免疫活性的变化，以探讨NDV作用于肿瘤细胞的机制。1 材料和方法1.1 实验材料NDV Lasota株购自四川省农科院，小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株、购自四川大学实验动

7、物中心，人乳腺癌细胞株MCF7、宫颈癌Hela细胞株、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、购自四川大学华西医院移植免疫实验室。RPMI1640培养基、小牛血清等常规试剂购自成都基因生物工程公司。近交系Balb/C小鼠40只，体重1822g，68周，购自四川大学实验动物中心。1.2 实验方法1.2.1 NDV对肿瘤细胞的体外生长抑制实验用含10%小牛血清的RPMI1640培养基(含链霉素100g/ml及青霉素100U/ml)，在37.5、5%的CO2培养箱中培养MCF7、Hela、HepG2、A549细胞株，取对数生长期的细胞各100l接种于96孔培养板，待24h细胞贴壁生长后，将ND

8、V Lasota株用RPMI1640培养液(无血清及双抗)稀释为2×106、4×106、8×106 PFU/ml 3种浓度，加入培养板，每种浓度设3个复孔，另设对照组，实验中仅加1640培养液，不加肿瘤细胞。连续培养48h后，用苔盼兰染色，倒置显微镜进行细胞形态学观察，计数，所得结果计算其平均值，同时采用MTT法，用酶联免疫仪测定570nm处OD值，按下面公式计算不同作用时间后癌细胞的存活率：癌细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%1.2.2 NDV免疫小鼠的动物实验(1)NDV转染肿瘤细胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培养基，在37.5、

9、5%的CO2培养箱中培养小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株，待其生长至对数期时，用1640培养液调节其浓度为4×106/ml后，加入纯化后NDV病毒 50ml，继续培养48h。(2)免疫接种：将40只小鼠随机分成免疫组和对照组，每组各20只，进行免疫接种。免疫组：将NDV Lasota作用后的小鼠黑色素瘤细胞分别多点接种于小鼠的尾部及两腋，数量为1.6×105，接种7d后，再用小鼠黑色素瘤细胞1.6×105在其背部皮下接种，观察病毒作用后的癌细胞接种于小鼠后，对其免疫功能的影响。对照组：用未经NDV处理的小鼠黑色素瘤细胞直接皮下接种。两组小鼠均于接种2周后，用眼球摘除法

10、处死，再测定其免疫活性。(3)NK活性测定：小鼠采用眼球摘除法处死后，取其脾制备效应细胞，以Hela细胞作为靶细胞，按校靶比501，251，分别加入96孔板，每组设复孔3个，于37.5、5%的CO2培养箱培养，24h后计数cpm，按以下公式计算NK活性：NK活性=(实验组cpm-自然释放组cpm)/(最大释放组cpm-自然释放组cpm)×100%。1.3 统计分析2 结果2.1 NDV对肿瘤细胞的杀伤作用NDV作用肿瘤细胞后，随着病毒作用时间增加，癌细胞生长明显受到抑制，数目逐渐减少，而且形态出现萎缩，存活率显著降低;而对照组癌细胞增长迅速，形态未见明显改变，见表1。采用不同剂量的N

11、DV病毒，作用于癌细胞株，亦得出相同结果，而且依细胞株不同，其抑制效应存在一定差别，对单一癌细胞株而言，都可能存在一个较佳的抑制剂量(P<0.01)，并且随着病毒剂量继续增加，抑制作用反而降低，见表2。表1 NDV作用后癌细胞的存活率(略)表2 NDV病毒对肿瘤细胞的生长抑制作用(略)2.2 NDV处理肿瘤细胞后，对小鼠NK细胞活性的影响实验表明，经NDV处理后的黑色素瘤B16细胞株，再免疫接种小鼠，接种后小鼠NK细胞活性显著增强，提示免疫接种使小鼠细胞免疫功能得到提升，再次接种瘤株，其NK细胞活性仍保持在较高的水平，与直接接种的对照组呈显著差异(P<0.05)，见表3。表3 ND

12、V处理后小鼠NK细胞活性(略)3 讨论研究表明NDV作为肿瘤细胞修饰剂具有组织亲和性的免疫刺激特性，能够在肿瘤细胞质中有选择的复制而且不依赖细胞增殖，使用安全。NDV感染肿瘤细胞后，介导粘附分子(神经氨酸酶HN等)产生，改善抗原呈递，诱导细胞因子和趋化因子产生，同时NDV亦可诱导T细胞共刺激活性，共刺激转李梦颖!信号使T细胞的活化域值大大降低，使T细胞对抗原的刺激更敏感，从而增强了机体的免疫识别能力和免疫活性 46。本实验用NDV作用于不同的人恶性肿瘤细胞株。我们发现，经其处理后的人乳腺癌细胞株MCF7、宫颈癌Hela细胞株、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2，其癌细胞形态都发生较大

13、的改变，包括细胞萎缩、脱落及活性降低，表明其诱导了肿瘤细胞凋亡，该效应与病毒数量不呈正相关，但均存在一个域值，高于或低于此剂量，其抑制作用明显降低，甚至无效，这与国内外的研究相同 7,8。小鼠免疫动物实验发现，经合适剂量感染修饰后的小鼠黑色素瘤细胞，其增殖活性提高，对再次接触到瘤细胞，具有一定的识别能力，可使小鼠的NK细胞活性保持在较高的水平，提示可能对肿瘤细胞产生了某种影响，增强了细胞的免疫原性，从而介导机体的细胞免疫，产生抗肿瘤作用。本研究表明，NDV在体外能够选择作用于肿瘤细胞株，对肿瘤细胞的增殖和活性均有较大影响，但具体机制尚未完全明了，仍需进一步的研究。【参考文献】1Bian H,

14、Fournier P, Moormann R, et al. Selective gene transfer in vitro to tumor cells via recombinant Newcastle disease virusJ. Cancer Gene Ther，2005,12(3): 295303.2Phuangsab A, Lorence RM, Reichard KW, et al. Newcastle disease virus therapy of human tumor xenografts: antitumor effects of local or systemic

15、 administrationJ. Cancer Lett，2001,17(2): 2736.3Avki S, Turutoglu H, Simsek A, et al. Linical and immunological effects of Newcastle disease virus vaccine on bovine papillomatosisJ. Vet Immunol Immunopathol，2004,98(1): 9164Schirrmacher V, Feuerer MB, eckhove P, et al. T cell memory, anergy and immunotherapy in breast cancerJ. J Mammary Gland Biol Neoplasia，2002,7(2): 201208.5刘开扬,刘芳.新城疫病毒抗癌作用及其应用的研究进展.中国肿瘤生物治疗杂志，2002,9(4): 289291.6Ertel C, Millar NS, Emmerson PT, et al.Viral gemagglutinin augments peptide specific cytotoxic Tcell responsesJ. Eur J I