乙型肝炎病毒大蛋白是一个转录激活子

1、原 文：The Hepatitis B Virus Large Surface Protein (LHBs Is aTranscriptional Activator作 者：EBERHARD HILDT, GESINE SAHER, VOLKER BRUSS, and PETER HANSHOFSCHNEIDER作者单位：1 Department of Virus Research, Max-Planck-Institut furBiochemie, Am Klopferspitz 18a, D-82152 Martinsried, Germany;2 Department of Medica

2、l Microbiology, University of Gottingen,Kreuzbergring 57, D-37075 Gottingen, Germany发表刊物：VIROLOGY 225, 235239 (1996 ARTICLE NO. 0594以下为中文翻译稿：乙型肝炎病毒大表面蛋白是一个转录激活子摘要：已有报道称C端截短的乙型肝炎病毒中表面蛋白（MHBst ）能作为转录激活子起作用，该功能依赖于MHBst N端PreS2结构域的胞质定位。在野生型MHBs中，PreS2结构域翻译时转移至内质网（ER）腔。最近有报道显示，HBV大表面蛋白（LHBs）的PreS2结构域在翻译完

3、成后先停留在ER膜的胞质面。LHBs是否与MHBst 具一样的转录激活功能？我们发现，与MHBst 相似，LHBs也确实能激活一系列启动子元件。有证据表明LHBs能PKC-依赖地活化AP-1和NF-B。PKC下游的c-Raf-1激酶的功能是AP-1和NF-B依赖LHBs活化的先决条件，因为对c-Raf-1激酶的抑制能消除AP-1和NF-B的LHBs-依赖的转录水平的活化。HBV 表面抗原基因由一个单独的ORF 组成。该ORF 被分割成三个分别起始于三个同框ATG 密码子的编码区preS1、preS2、s，相应的蛋白结构域为PreS1、PreS2、S。第一个ATG 翻译起始合成大的肝炎表面抗原（

4、LHBs），包括PreS1、PreS2和S；第二个ATG 起始合成中表面蛋白（MHBs，包括PreS2和S）；第三个ATG 起始合成小表面蛋白（SHBs，包括S）。三个HBV 表面蛋白都是组成膜蛋白。MHBs 具单糖基化和双糖基化两种形式，糖基化发生在PreS2的第4个氨基酸和S 的第146个氨基酸；LHBs和SHBs 都是单糖基化，糖基化发生在S 的第146个氨基酸。令人惊讶的是，LHBs也是单糖基化，尽管它也含有第二个糖基化位点（PreS2的aa4）。最近的研究工作显示，LHBs的PreS1- PreS2定位于细胞质而不在翻译时转移跨过内质网膜（1-3）。该定位使得PreS2 aa4的糖基

5、化位点不能与糖基转移酶靠近。只有一部分的LHBs 的PreS1- PreS2在病毒组装时通过分泌途径在翻译后转移跨膜。在病毒颗粒中，有一部分的LHBs 的PreS1- PreS2出现在病毒表面。MHBs 和SHBs 以亚病毒颗粒的形式被分泌，而LHBs 的分泌则需要MHBs 和SHBs 的共表达。由MHBs 和SHBs 引发的LHBs 的超过量生产导致所有蛋白质滞留在细胞内（4-6）。当preS2/s基因3端截短时（至少跨膜结构域3的编码区被删除），所获得的MHBs 衍生物具转录激活功能（7-9）。与全长MHBs 不同，该转录激活子既不能被分泌也不被糖基化（10）。最近报道显示PreS2结构域

6、足够产生转录激活功能。结构蛋白MHBs与转录激活子MHBst 产生功能差异的原因在于N端PreS2结构域定位的不同：在MHBs中，PreS2定位于内质网腔（10，12）；而在MHBst 中，PreS2定位于胞质（11）。该定位使得与胞质内的结合伴侣相互作用成为可能。与PKC的直接相互作用对于触发HepG2 cells (1.0x106 细胞。pSVLM-S -能在不产生MHBs和SHBs的情况下表达LHBs蛋白，从而可以在没有HBV蛋白影响的条件下考察LHBs-依赖的转录激活。当-pSVLM S 与报告基因共转染时，我们观察到对CAT报告基因7至9倍的诱导效应。该诱导效应与pSVMHBst76

7、(编码aa76以后被截短的MHBst 蛋白（10）转染后的转录活化效应相近。等量的pUC19作为阴性对照同时共转染(Fig.1a。一系列最近限度的启动子(2xNF-B或3xAP-1和SV40早期启动子都能被LHBs所活化。这说明结构蛋白LHBs是一个具多效性的转录激活子。现在的问题在于，L蛋白在MHBs和SHBs存在时是否仍然具有转录激活功能。于是用上述报告基因与同时表达LHBs、MHBs和SHBs的pSVLHBs(1共转染HepG2细胞。与转染pSVLM-S -的细胞相比，稍有降低但仍有6至7倍的转录激活效应被观察到(Fig.1b。轻微的降低也许反映LHBs合成的减少。 FIG.1.LHBs

8、具转录激活功能。(a CAT 分析：报告质粒pSV2-CAT, p3xAP-1-CAT, or p2xNF-kB-CAT和表达质粒pSVLM-S-(编码LHBs,pSVMHBst76(编码MHBst76,或pUC19（阴性对照）共转染HepG2 细胞。其中的倍数取自四次独立转染实验的平均值，以对照载体为参照。(b CAT 分析：报告质粒pSV2-CAT, p3xAP-1-CAT, or p2xNF-kB-CAT和表达质粒pSVLHBs (编码LHBs, MHBs, and SHBs,pSVMHBst76(编码MHBst76, or pUC19（阴性对照）共转染HepG2 细胞。其中的倍数取自四

9、次独立转染实验的平均值，以对照载体为参照。 FIG. 2. LHBs 的转录激活功能依赖PKC and c-Raf-1 kinase 。CAT 分析：pSVLM-S-与报告基因p3xAP-1-CAT or p2xNF-kB-CAT共转染HepG2细胞。pSVMHBst76共转染作阳性对照；pUC19共转染作阴性对照。其中的倍数取自四次独立转染实验的平均值，以对照载体为参照。(a细胞培养液中含0.1 m M H7以抑制PKC或者将细胞在转染前暴露于200 ng/ml TPA 30hr以将细胞培养液中的PKC耗尽。 (b pHCR13.1（编码c-Raf-1激酶阴性突变体）、pSVL M-S-,

10、或 pSVMHBst76 与报告基因p2xNF-kB-CAT或p3xAP-1-CAT共转染细胞。作为对照，用pMNC与报告基因共转染细胞。研究表明，MHBst 依赖的转录激活是由PKC依赖的c-Raf-1/MAP2-激酶信号转导途径的活化所介导(Hildt et al., submitted。LHBs-依赖的转录激活是否也由相同的信号传导途径所触发？首先在PKC抑制因子H7存在时进行共转染实验：当培养液中含0.1mM H7时，报告基因p3xAP-1-CAT或p2xNF-kB-CAT LHBs依赖的活t76化完全消失(Fig.2a；以前报道的报告基因MHBs依赖的活化作用被抑制的现象(Hildt

11、 et al., submitted for publication也有被观察到。（克隆载体pUC19转染细胞作为阴性对照。）因为H7不具完全的PKC特异性，又在转染前30小时内通过连续的TPA刺激(100ng/ml耗尽培养液中所有的PKC。在这样的条件下，LHBs-t76依赖的和MHBs-依赖的NF-kB- (7倍于对照 和AP-1- (9倍于对照报告基因的活化都被抑制（1.3-到1.5-倍于对照）。这些结果表明，LHBs-依赖的转录活化可由PKC的活化所介导(Fig.2a。在MHBst 表达细胞中，c-Raf-1激酶的功能对于触发AP-1和NF-kB的活化十分重要(Hildt et al.

12、, submitted for publication。为了调查AP-1和NF-kB的LHBs-依赖的转录活化是否也由c-Raf-1激酶的活化所介导，1.5g表达质粒pSVLM -S - 、报告基因p3xAP-1-CAT(1g或p2xNF-kB-CAT(1.5g与1.5g pHCR13.1（编码c-Raf-1激酶阴性突变体）(14一起共转染1.0x106 HepG2细胞。c-Raf-1激酶阴性突变体的共表达导致AP-1（1.7倍）和NF-kB（1.4倍）的LHBs-t76依赖的活化完全丧失(Fig.2b。阳性对照转录因子的MHBs依赖的活化也完全消失。在对照实验中（pHCR13.1被克隆载体p

13、MNC所代替）LHBs- or MHBst76 -依赖的转录因子的活化仍然有被观察到。但AP-1和NF-kB的LHBs-依赖的活化作用的抑制是否是由pHCR13.1的非特异性毒性所致呢？用pHCR13.1和报告质粒p2xNF-kB-CAT共转染细胞，加入H2O （终浓度为500M）刺激细胞。结果显示， H2O 22依赖的NF-kB的活化不被c-Raf-1激酶阴性突变体的共表达所影响。因此，LHBs-依赖的转录活化由c-Raf-1激酶所介导。但是，用c-Raf-1激酶表达质粒pMNC-c-raf代替pHCR13.1转染细胞，提高细胞内源c-Raf-1激酶水平并不能显著增强报告基因的LHBs- o

14、r MHBs t76-依赖的活化水平。综上所述，内源c-Raf-1激酶的水平并不能限制性触发AP-1或 NF-kB的LHBs-依赖的活化。总言之，本研究发现LHBs确实是一个转录激活因子，并且LHBs-依赖的转录t 活化，与MHBs依赖的转录激活一样，由PKC依赖的c-Raf-1/MAP2-激酶信号转导途径的活化所介导。相同的靶物质（即AP-1 或NF-b）被活化；和c-Raf-1激酶能是由PreS2区域的细胞质定位所产生的。转录激活似乎并不是由引起细胞内分子水平增高的LHBs的内质网滞留所引起。30 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine）条件下的共转染实验表明

15、这样的条件对于转录激活功能并没有显著影响（数据未发表）。体内LHBs连续的过表达会导致转基因老鼠中毛玻璃样肝细胞（ground glass hepatocytes）的产生(5，表现为细胞内大量LHBs的存在。在转基因老鼠模型上还能看到肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的产生。目前认为HCC的发展是由体内LHBs连续的过表达造成的持续煽动过程所引发。因为LHBs的过表达导致一些控制细胞增殖的激酶的活化(PKC, c-Raf-1 kinase，这些酶的连续活化可能与肝癌的发生具一定的相关性。根据癌症发生机制的多因子模型，LHBs 的连续表达可能具有肿瘤促发功能。L

16、HBs对于病毒粒子的组装十分重要。根据现有结果，我们预测其第二个功能是通过病毒启动子元件的转录激活参与病毒复制。这似乎与HBx（乙型肝炎病毒X蛋白）相类似。尽管HBx的功能不是HBV复制的先决条件，但HBx通过对病毒和/或细胞启动子的转录激活参与病毒复制(15。具体说来，在肝细胞刚被感染HBx还没产生时，LHBs能代替HBx发挥作用；其后，LHBs与HBx共同发挥作用。这也许可以解释为什么HBx，至少在体外，不是HBV复制所必需的。还需要注意的是，LHBs 的转录激活功能可能使乙型肝炎携带者患HCC的可能性增大，因为这些携带者也是LHBs阳性。 参考文献： 1. Bruss, V., Lu,

17、X., Thomssen, R., and Gerlich, W., EMBO J. 13, 22732279 (1994. 2. Ostapchuk, P., Hearing, P., and Ganem, D., EMBO J. 13, 10481057 (1994. 3. Prange, R., and Streek, G., EMBO J. 14, 247256 (1995. 4. Chisari, F. V., Filippi, P., McLachlan, A., Milich, D. R., Riggs, M., Lee, S., Palmiter, R. D., Pinkert

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