低密度脂蛋白受体相关蛋白基因两种多态性与阿尔茨海默病的关系

1、    低密度脂蛋白受体相关蛋白基因 两种多态性与阿尔茨海默病的关系        摘要：目的探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)基因两种多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的相关情况。方法应用分子生物学技术，在42例患者和40名正常人中观察LRP基因、ApoE基因多态性的分布，进行关联分析。结果AD与LRP基因上游区域5端插入序列多态性无关联；AD与LRP基因外显子3多态中的等位基因C正关联(RR=2.362， P<0.05)，

2、与基因型C/C正关联(RR=2.710，P<0.05)；AD与ApoE基因4等位基因正关联(RR=3.194，P<0.01)，与4/3基因型正关联(RR=3.148，P<0.05)，但与4/2基因型无关；无ApoE 4等位基因的AD与LRP C/C基因型正关联(RR=6.842，P<0.05)，有ApoE 4等位基因的AD患者与LRP C/C基因型无关联(RR=1.857，P>0.05)。结论ApoE 4是AD发病的风险因子；LRP基因多态性与AD正关联是由于LRP基因C/C型在患者中过表达所致；LRP基因C/C型是无ApoE 4的AD患者发病的风险因子。关键词：

3、阿尔茨海默病；受体，免疫；载脂蛋白E类；基因Two polymorphisms in the LRP gene and Alzheimers diseaseBI ShengWANG Desheng, ZHANG Yuet al.（Department of Neurology, the First Clinical College of Harbin Medical University, Harbin 150001, China）Abstract：ObjectiveTo examine the asssociation of two low-density lipoprotein recep

4、tor-related protein (LRP) gene polymorphisms with sporadic late-onset Alzheimers disease(AD). MethodsThe two polymorphisms in the LRP gene were genotyped in 42 AD cases and 40 controls with molecular biological methods. The apolipoprotein E (ApoE) gene polymorphism was also genotyped. Results， ，P<

5、;0.05) for the LRP exon 3 polymorphism; AD was associated with ApoE ，P<0.01) and genotype ，P<0.05); there was association between AD without ApoE ，P<0.05). ConclusionsThe ApoE 4 is a risk factor of AD; the AD is associated with LRP exon 3 polymorphism because of over-represented C/C genotyp

6、e of LRP gene; C/C genotype of LRP gene may be an independent risk factor of AD patients without ApoE 4.Key words：Alzheimers diseases; Receptors, immunogic; Apolipoproteins E; Genes 载脂蛋白E(ApoE)基因决定阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)发病的遗传易患性，但其分子生物学机制目前还不清楚。ApoE的主要受体是低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)，且LRP与ApoE及淀粉样前体蛋白(APP)

7、共存于AD的病理特征老年斑中，并调节着二者的代谢。因此，LRP作为AD的一个候选基因受到了普遍关注。目前尚未发现LRP基因存在着诱发AD的错义突变，但位于LRP基因5端上游区域插入序列和外显子3存在着遗传多态。我国尚未见这方面的报道。为此，我们对AD患者LRP基因两种多态性及ApoE基因多态性进行了初步研究，现将结果报道如下。资料和方法一、资料所有病例由哈尔滨医科大学一院和白求恩医科大学一院提供。诊断根据简易精神状态检查表(MMSE)，长谷川痴呆量表初筛作出痴呆的诊断，再采用美国国立神经病语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)标准作出AD诊断。以健康老

8、年人为正常对照。本研究含AD患者42例，其中男23例，女19例，年龄6079岁，平均(70.4±6.6)岁；对照组40名，男24名，女16名，年龄6081岁，平均(68.1±4.3)岁。两组研究对象均为随机选择，无血缘关系。二、方法1. 基因组DNA的提取：按常规方法提取外周血白细胞基因组DNA。2. LRP基因5端上游区域插入序列多态性检测1：引物为：5-TGTAAGGTGAGAGAATG-CATA-3和5-TGGGCA- ACAAGAGTGCAACTCCA-TC-3。PCR条件：943 min，35次循环(94 30 s，56 30 s，71 60 s)，70 5 mi

9、n。取PCR产物10 l，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，固定，银染，显色，根据电泳带型确定基因型（1）。1，3：纯合基因型A1/A1(91 bp/91 bp)；2：纯合基因型A2/A2(87 bp/87 bp)；4：杂合基因型A1/A2(91 bp/87 bp)；M：核苷酸分子量标准pBR322/Msp IDNA Marker1LRP基因5端上游区域插入序列多态性检测结果3. LRP基因外显子3多态性检测2：引物为：5-GGGGTCCAGGACTG-CATGTA-3和5-AA-GTCCGTACCTCGGC- AGTG-3。PCR条件：94 3 min，32次循环(94 30 s，54 30

10、s，72 30 s)，72 3 min。取PCR产物5 l，加5 U RsaI内切酶，37酶切过夜，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，固定，银染，显色，根据电泳带型确定LRP基因型（2）。1：纯合基因型T/T(51 bp/51 bp)；2：纯合基因型C/C(32 bp/32 bp)；3：杂合基因型C/T(32 bp/51 bp)；4：PCR产物(分子量大小为59 bp)；M：核苷酸分子量标准pBR322/Hae III DNAMarker2LRP基因外显子3多态性检测结果4. ApoE基因型检测3:引物：5-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3和5-ACAGAATTCG

11、CCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3。PCR条件：95 5 min，35次循环(94 30 s，65 30 s，72 90 s)，72 5 min。取PCR产物10 l，加20 UHhaI内切酶，37酶切过夜，10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，固定，银染，显色，根据电泳带型确定ApoE基因型（3）。16基因型依次分别为4/4，2/2，3/3，3/4，2/4，2/3；M：核苷酸分子量标准pBR322/Msp I DNA Marker3ApoE基因型检测结果5. 统计学处理： 计算各等位基因和基因型频率的分布，吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡；用卡方检验进行显著性分析

12、。采用Woolfs法计算相对危险率(RR)，对AD与LRP基因两种多态性或ApoE基因进行关联分析。结果1. LRP基因5端上游区域插入序列多态中各等位基因和基因型频率分布：见表1。表1各组低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)基因上游区域5端插入序列基因型和等位基因频率分布组别例数基因型 等位基因A1/A1A1/A2A2/A2A1A2AD组 420.310 0.071 对照组40 0.325 0.050 0.788 注：A1为91 bp， A2为87 bp 2. AD患者与正常人LRP基因外显子3多态中各等位基因和基因型频率分布：见表2。结果表明：AD与等位基因C正关联(RR=2.362，P&l

13、t;0.05)；与基因型C/C正关联(RR=2.710，P<0.05)。表2各组低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)基因外显子 3基因型和等位基因频率分布组别例数基因型 等位基因C/C C/TT/TCTAD组 42*0.047 * 对照组40 0.575 0.325 0.738 注：与对照组比较，*P<0.05 3. AD患者与正常人ApoE各等位基因和基因型频率分布：见表3。结果表明：AD患者与ApoE基因4等位基因正关联(RR=3.194，P<0.01)，与4/3基因型正关联(RR=3.148， P<0.05)，但与4/2基因型无关。4. 有或无ApoE 4等位基因的

14、AD患者与LRP基因外显子3多态性关联分析： 我们按照是否具有ApoE 4等位基因将AD患者分为两组，分别与相应对照组进行比较。AD组和对照组中不具有ApoE 4等位基因的例数分别为22和32例，其中具有LRP C/C 基因型者分别为20和19例。分析结果表明，在有ApoE 4等位基因的群体中，AD与LRP基因外显子3多态性之间无关联(RR=1.857，P>0.05)；而在无ApoE 4等位基因的群体中，AD与LRP基因的C/C 基因型正关联(RR=6.842，P<0.05)，表明无ApoE 4的AD患者的发病可能是由LRP基因C/C型过度表达所致。表3各组载脂蛋白E(ApoE)基

15、因型和等位基因频率分布组别例数基因型 等位基因2/23/34/43/24/34/2234AD组 420.000 0.048 0.048 *0.071 0.679 *对照组40 0.025 0.000 0.075 0.150 0.050 0.088 0.812 注： 与对照组比较，*P<0.05，*P<0.01 讨论LRP基因位于第12号染色体上，全长92 kb，由89个外显子组成。在LRP基因的上游区域具有多态性，由四核苷酸重复序列(TTTC)n形成，具有4种等位基因，它们的区别仅在于1个四核苷酸重复序列。其中91 bp和87 bp等位基因出现的频率最高，95 bp和83 bp等位

16、基因的频率较低，在某些人群中甚至极为罕见。本研究也未能检测出95 bp和83 bp两种等位基因，但所检测到的三种基因型与AD之间均无关联。这可能由于该多态受很多因素，如种族、地理环境等的影响，值得进一步探讨。LRP基因外显子3的多态性位点位于LRP cDNA的第766位核苷酸，由碱基C或T构成，相应地产生三种LRP基因型：纯合子C/C、T/T和杂合子C/T。虽然关于该多态与AD的关系尚存在争论4，但我们发现LRP等位基因C与基因型C/C与AD正关联，与文献报道一致5,6，表明本研究中LRP基因多态性与AD关联是由LRP基因C/C型所致，C/C型在AD患者中过度表达，导致AD组与对照组比较产生显

17、著性差异。本研究同时检测了ApoE基因多态性与AD的关系，发现ApoE基因等位基因4与AD正关联，这与冯颖等7的报道一致；表明ApoE基因多态性与AD的关联可能仅由等位基因4频率增高所致。本研究发现ApoE 4/3基因型与AD正关联，而4/2基因型与AD却无关联，我们认为可能是由于在进行ApoE基因分型后样本数量减少所致。有关LRP基因多态的功能目前尚不清楚，该多态性可能只是与另一种突变连锁不平衡，而这种突变位于LRP基因与ApoE基因或含ApoE脂蛋白结合的区域内，可改变AD病理过程中ApoE的作用；或可能位于与APP结合的区域内，调节APP的吸收和降解8。因而，进一步利用分子生物学手段，在

18、中枢神经系统中探讨LRP与ApoE或LRP与APP间的相互作用，将为AD的发生、发展提供新的线索。作者单位：毕胜（150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科）王德生（150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科）盛雨辰（150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科）韩辉（150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科）张昱（白求恩医科大学第一临床医学院神经内科）吴江（白求恩医科大学第一临床医学院神经内科）王守春（白求恩医科大学第一临床医学院神经内科）孔繁军（白求恩医科大学第一临床医学院神经内科）参考文献：1Zuliani G,Hobbs HH.Tetranucleoti

19、de length polymorphism 5 of the a2-macroglobulin receptor (A2MR)/LDL receptor -related protein (LRP) gene. Hum Mol Genet,1994,3:215.2Baum L,Dong ZY,Choy KW,et al.Low density lipoprotein receptor related protein gene amplification and 766T polymorphism in astrocytomas.Neurosci Lett,1998,256:5-8.3Wenh

20、um PR,Price WH,Blundell G,et al. Apolipoprotein E genotyping by one-stage PCR.Lancet,1991,337:1158-1162.4Clatworthy AE,Gomez-Isza T,Rebeck GW,et al.Lack of association of a polymorphism in the low-density lipoprotein receptor-related protein gene with Alzheimer disease. Arch Neurol,1997,54:1289-1292.5Hollenbach