人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良_图文

1、Shanghai Journal of Stomatology Vol.16No.3June,2007文章编号1006-7248(200703-0263-05人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良李树波1,李德懿1,葛锡锐2(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海市口腔医学重点实验室,上海市口腔医学研究所,上海200011;2.中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,上海200032摘要目的:改良人结合上皮(junctional epithelium,JE细胞的分离培养及冻存方法。方法:取正畸拔除的牙周组织健康的前磨牙,沿龈缘剪去冠方1mm左右的沟内上皮,用无菌11号刀片紧贴牙面刮下、

2、剪碎JE组织,简化培养操作步骤。取第2代JE细胞,加入冻存液,按设定的降温程序(从0开始,以每分钟下降1.5速度下降至-18,保持5min;再以每分钟下降20的速度降至-80,然后投入-196液氮罐冻存细胞,40水浴复苏,进一步研究JE细胞的形态、增殖、鉴定及复苏后存活率等生物学活性。结果:不用Dispase冷消化,采用0.1%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化,同样可成功地培养人JE细胞;JE细胞复苏后的存活率为(93.87±3.11%,生长状况良好,与第2代细胞相似;免疫细胞化学染色显示,培养的JE细胞角蛋白-19(cytokeratin-19,CK19表达强阳性,而波形丝蛋白(v

3、imentin表达也为阳性。结论:改良的JE分离培养与冻存方法可行,JE表型在体内和体外并非完全一致,可能与细胞生长的底物有关。关键词结合上皮;细胞培养;细胞冻存;免疫细胞化学中图分类号R780.2文献标识码AThe modification of culture and cryopreservation methods for human junctional epithelium cells LI Shu-bo1,LI De-yi1,GE Xi-rui2.(1.Shanghai Key Laboratory of Stomatology,Ninth Peoples Hospital,Sch

4、ool of Medicine,Shanghai Jiao Tong University;Shanghai Research Institute of Stomatology.Shanghai200011;2.Cell Resource Center,Institute of Life Science,Chinese Academy of Science.Shanghai200032,ChinaAbstractPURPOSE:To study the methods for isolating,culturing and cryopreserving junctional epitheliu

5、m(JEcells.METHODS:JE tissue samples were obtained from human periodontally healthy premolars which were extracted for orthodontic reasons.The sulcular epithelium was removed at a distance of1mm from the gingival margin.JE tissue was detached from the extracted teeth by using11#sterile blade and minc

6、ed into small fragments.The cultured JE cells were incubated with a freezing medium consisting of90%calf serum and10%DMSO.The freezing protocol was applied usinga computer-controlled freezer to freeze the medium to-80before cells were plunged into liquid nitrogen and stored.Theabove procedures were

7、optimized to further study the morphology,proliferation,determination of JE cells and measure the viability after thawing.RESULTS:0.1%trypsin containing0.02%ethylenediamine tetraacetate(EDTAdigestion was used to isolate JE cells successfully without dispase.The viability of thawing JE cells was(93.8

8、7±3.11%,and the morphology was similar to that of the second passage JE cells.CK19and vimentin were both positive in JE cells immunocytochemically.CONCLUSION:The methods could be applied into practice.The phenotype of JE cells in vitro is not always consistent with that in vivo.It might be asso

9、ciated with the substrate which cells grow in contact with.Supported by National Natural Science Foundation of China(Grant No.30672314and Research and Development Foundation of Shanghai Unilever.收稿日期2007-1-12;修回日期2007-03-20基金项目国家自然科学基金(30672314;上海-联合利华研究与发展基金作者简介李树波(1978-,男,博士研究生通讯作者李德懿,Tel:021-*,E-

10、mail:srisc2007年版权归上海口腔医学编辑部所有Key wordsJunctional epithelium;Cell culture;Cryopreservation;Immunocytochemistry Shanghai J Stomatol,2007,16(3:263-267.结合上皮(junctional epithelium,JE是牙龈组织附着在牙表面的一条带状上皮,是无角化、低分化的特殊组织。JE持续受到病原微生物的侵袭,或者作为靶细胞产生多种酶,如明胶酶、弹性蛋白酶及透明质酸酶等,它们破坏内侧基底板,使JE与牙面分离,上皮附着丧失,最终引发牙周炎的一系列临床症状。可见

11、JE是牙周炎发生的始发部位,也是牙周病学界研究的热点1。Gao及Takashi等2,3先后将人JE 组织块接种于3T3成纤维细胞滋养层或包被有可溶性基底膜成分的培养皿上,成功地培养出JE。但成纤维细胞的存在并不利于细胞代谢水平的检测。目前国内JE的研究刚刚起步,本实验组前阶段采用Dispase冷消化结合胰蛋白酶-EDTA消化法,在国内首次成功分离培养出人JE细胞4,但培养步骤繁杂,成功率低,且细胞冻存复苏后大多死亡,因此改良和优化JE的体外培养与保存条件势在必行。本研究对JE的分离培养及冻存方法进行了改进,现报道如下。1材料与方法1.1材料无血清角质细胞培养液(Gibco,Germany,0.

12、1%胰蛋白酶-0.02%EDTA(Gibco,Germany,胎牛血清(Hyclone,Germany,D-Hanks缓冲液(自配,内含400U/ml青霉素,400g/ml链霉素,二甲基亚砜(DMSO,Amersco产品。鼠抗人CK19(A53/BA2和波形丝蛋白(vimentin单克隆抗体(DAKO,USA,二抗试剂盒(生物素标记羊抗鼠IgG,辣根酶标记链霉卵白素,ZYMED,USA,3%过氧化氢液,0.01% Triton-100和10%中性甲醛溶液(自配,DAB显色液(DAKO,USA,PBS缓冲液(自配。百级层流室,37、5%CO2饱和湿度细胞培养箱(Heraeus,Germany,一

13、次性塑料培养皿/板(Orange,USA,离心机(Heraeus,Germany,倒置相差显微镜(Leica,Germany,Axioshop2Plus摄影显微镜(ZEISS,Germany,Casy细胞计数仪(SCH$RFE, Germany,WKL-98微机控制速率冷冻仪(北京四环科学仪器厂生产。1.2实验方法1.2.1JE细胞的取材、分离和培养在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科选择因正畸拔除的牙周健康的前磨牙,用11号刀片自龈沟底切向牙槽嵴顶(沟内切口,分离牙龈,拔出后迅速放入含青链霉素双抗的D-Hanks液中。用眼科剪沿龈缘剪去冠方约1mm左右的沟内上皮,然后用无菌11号

14、刀片紧贴牙面刮下JE组织,剪碎成2mm3左右的组织块,D-Hanks反复漂洗,不用Dispase冷消化,直接加0.1%胰蛋白酶-0.02%EDTA,37震荡消化15min,80目不锈钢滤器过滤,加无血清角质细胞培养液,制成2×104个/ml的细胞悬液,37、5% CO2培养箱培养。1.2.2JE细胞的形态、增殖和免疫细胞化学特征倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况,取生长旺盛的第2代细胞,制成细胞悬液,以1×104个/孔密度接种于24孔板,每天计数3孔细胞数,取其均值。以细胞数和培养天数绘制生长曲线,计算倍增时间。常规检测细胞角蛋白(cytokeratin和波形丝蛋白(v

15、imentin的表达。1.2.3JE细胞的冻存与复苏备冻细胞的预处理:生长良好的第2代JE细胞收集于离心管中,离心去上清后,加入1ml冻存液(二甲基亚砜与胎牛血清的比例为19,用吸管反复吹打,使细胞均匀,最终浓度为2.0×106个细胞/ml,然后转移至无菌塑料冻存管内。冻存细胞的处理:设定降温程序,从0开始,以每分钟下降1.5速度下降至-18后,保持5min;再以每分钟下降20的速度降至-80。将冻存管置入安装有程控降温速率仪的冷冻箱内,按设定的降温程序降低箱内的温度。当温度降至-80(即液氮口时,放置1d后打开冷冻箱,将包有冻存管的布袋迅速投入液氮(-196中。冻存细胞的复苏:冻存

16、管从液氮罐中取出,快速放入预热至40的温水浴中,并不时振动使其尽快融化。将细胞用吸管吸出,转入离心管中,一部分采用Casy细胞分析仪计算存活率,另一部分制成细胞悬液,接种于培养皿中,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,上述实验重复3次。2结果2.1JE细胞的一般生物学特性不用Dispase 冷消化,能成功地分离培养人JE 细胞,其形态、生长规律和以往报道4一致。原代JE 细胞形态多样,为扁平形、梭形和卵圆形(图1A 。第1代细胞2448h 后贴壁伸展,细胞克隆融合成片,大小不一,排列紊乱。第2代细胞生长旺盛,形态良好,与原代相似(图1B 。从第3代起,细胞体积变大,出现“巨细胞”(图1C ,且随

17、传代次数增加,细胞形态更加不规则,增殖缓慢,最终第5代细胞衰老死亡(图1D 。根据生长曲线(图2,采用公式计算出JE 的倍增时间为40.3h 。2.2JE 细胞的免疫细胞化学染色JE 细胞CK19染色为强阳性,vimentin 染色为阳性(图3。2.3JE 冻存细胞的复苏与形态观察复苏后的JE 细胞生长良好,呈多角形,大小不一,轮廓清晰(图4,与第2代细胞相似(图1B 。细胞存活率为(93.87±3.11%(图5。图1.培养的人JE 细胞。A.原代,B.第2代,C.第3代,D.第5代(×100Figure 1.The cultured human JE cells.A.Pr

18、imary culture,B.The second passage,C.The third passage,D.The fifth passage (×100AB图3.第2代JE 细胞免疫细胞化学染色。A.CK19染色为强阳性,B.Vimentin 染色为阳性(×100Figure 3.The immunocytochemical staining of the second JE cells.A.CK19was strongly stained in JE cells,B.Vimentin was positive (×100图4.复苏后的JE 细胞形态无明显

19、变化,与第2代细胞相似(×100Figure 4.The morphology of thawing JE cells showed no significant alterations,and was similar to that of the second passage JE cells (×100图5.JE 细胞复苏后的存活率。A.细胞碎屑,B.死细胞,C.活细胞Figure 5.The viability of thawing JE cells.A.Cellular debris,B.Dead cells,C.Living cells细胞数(个/m l 培养时间

20、(d 图2.第2代JE 细胞的生长曲线Figure 2.The growth curve of the second passage JE cells12000010000080000600002000012345678Shanghai Journal of Stomatology Vol.16No.3June,20073讨论JE位于沟内上皮的根方,呈领圈状附着于牙冠或牙根表面。JE的长度约0.251.35mm,仅1020细胞层厚,因此培养能否成功,取材是关键。Takashi等3于颊侧距龈缘12mm处作内斜切口和沟内切口,拔除健康牙,用眼科剪剪去牙龈上皮及其下方的结缔组织,以便获取JE。一方面

21、该法需作手术及患者的密切配合,另一方面在修剪过多组织时,不易把握操作的精确度。本实验利用因正畸而拔除的健康牙,直接采用沟内切口分离牙龈,简化了上述取材步骤。此外,对JE组织的处理方法与以前不同,并未浸入Dispase溶液中,而是直接采用胰蛋白酶消化分离。Dispase是一种分离上皮与真皮的中性蛋白酶,在分离上皮时,作用于基底膜,选择性地分解纤维连接素和型胶原,而保存上皮细胞的活性和连接,在口腔医学研究中,已被广泛用于培养牙龈上皮细胞(gingival epithelium,GE5。而JE是龈牙结合部的特殊组织,通过内侧基底板和外侧基底板分别与牙面和牙龈结缔组织相连接2。Oksanen等6比较了

22、鼠JE 与GE的基底板组成,发现JE的外侧基底板与GE 不同,且JE的内侧基底板只含有层黏连蛋白-5,可见JE的内侧基底板并非真正意义上的“基底膜”,因此分离JE Dispase是否必要还受到质疑。胰蛋白酶消化法是较为常用的分离组织方法。该法受其浓度、温度、pH值、消化时间、组织块大小的影响,浓度过大、消化时间过长,细胞都会被消化掉。但当选择合适的参数时,胰蛋白酶经济、适应范围广和可操作性强又是其他酶所不可比拟的。经过反复摸索,发现0.1%胰酶浓度较为有效。JE细胞原代培养时可能存在成纤维细胞污染,无血清培养液及其中的低浓度钙离子(<0.5mmol/L可以抑制成纤维细胞生长。倒置相差显微

23、镜下观察证实,JE细胞的生长规律与以往报道一致。由于JE细胞体外培养难度较大,生命周期短,衰老较快,因此对其进行低温保藏无疑是保存的理想方法。但降温速度的快慢与细胞的冻存效果有直接关系:降温速度太快,影响细胞内水分透出,而太慢则促进冰晶形成。以前将装有备冻细胞的冻存管直接放入液氮口,1天后投入到液氮罐中,结果细胞复苏后大多死亡。本实验采用含10%DMSO的冻存液,效果较好。DMSO可以加快结晶过程,减少冰晶形成,对细胞膜具有保护作用。另外,使用程序控制冷冻仪,慢冻快融,可以最大限度地保存细胞活性。传统检测细胞活力的方法多采用台盼蓝染色,其只适用于检测坏死细胞,但如细胞发生凋亡,仍有排除染料的能

24、力,且随时间点不同,计数差异亦较大,故台盼蓝不能作为鉴定细胞精确死亡的标准7。Casy 细胞计数仪可以弥补上述缺点,其数据结果准确、可靠,为培养工作提供了极大方便。关于细胞来源的鉴定,一般来说外胚层来源的上皮细胞,细胞角蛋白(cytokeratin,CK的表达呈阳性反应、波形丝蛋白(vimentin呈阴性反应,而中胚层来源的间充质细胞则相反。有研究发现,CK19可作为JE的特征性标志物8,本实验证实体外培养的JE细胞CK19表达为强阳性,而vimentin也为阳性。Altman等9以3T3成纤维细胞作为滋养层,包被有可溶性基底膜成分的培养皿培养大鼠JE细胞,发现CK19表达为阳性,而vimen

25、tin为阴性,符合外胚层来源的细胞特性。但Bampton等10将培养的人JE和GE细胞与JE和GE组织进行CK19和vimentin染色,发现CK19体内与体外表达无区别,vimentin在体外培养的JE和GE细胞为阳性,而在组织切片中表达为阴性,提示JE和GE细胞表型在体内与体外并非完全一致,可能与其生长的底物有关。目前主要有2种假设可以解释这一现象:上皮下结缔组织对复层鳞状上皮的表型有诱导作用,影响上皮的结构与功能。在口腔中,由于JE受牙周韧带的影响, GE受固有层的影响,它们之间在时间和空间上的详细作用机制还有待进一步研究。JE解剖部位特殊,通过内侧基底板与牙面相互附着。有学者利用可溶性

26、基底膜培养JE细胞,该基底膜主要包括层黏连蛋白、纤维黏连蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质成分,它们与JE细胞通过“上皮附着装置”而相互连接,且在两者之间传递分子信息,可能最终对JE细胞的基因表达和分化具有调控作用11。参考文献1Bosshardt DD,Lang NP.The junctional epithelium:from health todiseaseJ.J Dent Res,2005,84(1:9-20.2Gao Z,Mackenzie IC.Patterns of phenotypic expression of humanjunctional,gingival,and reduced

27、 enamel epithelia in vivo and invitroJ.Epith Cell Biol1992,1:156-167.3Takashi M,Yuichi I,Takeshi S.Culture and characterization ofhuman junctional epithelial cellsJ.J Periodontol,1997,68:229-239.4姜茜,李德懿,葛锡锐,等.人结合上皮和口腔龈上皮细胞分离培养及生物学特性比较J.上海口腔医学,2005,14(6:608-612. 5Stenn KS,Link R,Moellmann G,et al.Dis

28、pase,a neutral pro-tease from bacillus polymyxa,is a powerful fibronectinase and col-lagenaseJ.J Invest Dermatol,1989,93(6:287-290.6Oksanen J,Sorokin LM,Virtanen I,et al.The junctional epitheli-um around murine teeth differs from gingival epithelium in its basement membrane compositionJ.J Dent Res,2

29、001,80(12: 2093-2097.7杨景山.医学细胞化学与细胞生物学M.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1990:430-441.8姜茜,李德懿.人牙龈结合上皮、口腔牙龈上皮及沟内上皮中细胞角蛋白的表达J.中华口腔医学杂志,2005,40(4:298-301.9Altman LC,Nelson CL,Povolny B,et al.Culture andcharacterization of rat junctional epitheliumJ.J Periodontal Res, 1988,23:91-99.10Bampton JM,Shirlaw PJ,Simon T

30、,et al.Human junctional ep-ithelium:Demonstration of a new marker,its growth in vitro and characterization by lectin reactivity and keratin expressionJ.J Invest Dermatol,1991,96:708-717.11Pitaru S,Mcculloch CAG,Narayanan SA.Cellular origins anddifferentiation control mechanisms during periodontal de

31、velopment and wound healingJ.J Periodontal Res,1994,29:81-94.头颈部血管瘤与脉管畸形出版发行由张志愿、赵怡芳教授主编,郑家伟、秦中平教授副主编的我国第一部有关血管瘤和脉管畸形的专著头颈部血管瘤与脉管畸形(IS-BN:978-7-5062-7471-5/R111作为口腔医学精粹丛书之一,于2007年5月由世界图书出版(上海公司出版发行。该书的出版发行,填补了我国在该领域的空白。脉管性疾病(vascular anomalies是婴幼儿期最常见的良性肿瘤或发育畸形,文献报道,血管瘤在新生儿的发病率为1.1%2.6%,1岁时的发病率高达10%

32、。其中,35%60%发生在头颈部。虽然脉管性疾病属于良性病变,但发生在颌面颈部的病变,不仅导致严重的容貌毁损,还可能因为阻塞呼吸、消化道而影响发音、进食,甚至导致出血、窒息并危及生命。20世纪80年代以前,国内外对于脉管性疾病的分类、诊断比较混乱,笼统称为血管瘤,以至于在治疗上常因“治疗过度”而带来许多后遗症或“治疗不足”而贻误时机。1982年,哈佛大学医学院儿童医学中心整形外科的Mulliken和Glowacki教授,根据多年的临床与基础研究,率先提出了脉管性疾病的生物学分类方法(biological classification,澄清了长期以来对两类疾病的模糊认识,明确提出将脉管性疾病分为

33、血管瘤和脉管畸形,前者是具有血管内皮细胞异常增生的肿瘤或类肿瘤性疾病,后者则是无内皮细胞异常增生的非肿瘤性先天性发育畸形,两者的生物学行为和自然病史有着本质的差异,因此治疗方法完全不同。Mulliken和Glowacki的生物学分类,在脉管性疾病的治疗和研究史上具有里程碑式的意义,得到了世界各国学者的广泛认同。1988年, Mulliken和Young合作出版了血管胎记:血管瘤和畸形一书,根据新的分类,对血管瘤、脉管畸形的诊断和治疗,进行了详细的、全新的论述。1976年,Mulliken和Young在Boston发起成立国际脉管性疾病专题研究组(Workshop,由于是一个新兴的领域,且横跨几

34、个学科,因此最初只是邀请几个专业的学者进行开放式讨论。其后,与会者逐渐增多,每2年在欧洲或美国的城市举行1次会议。1992年,在Budapest,决定将该组织正式命名为国际脉管性疾病研究学会(International Society for the Study of Vascular Anomalies,简称ISSVA。经过2年的传真联系和讨论,1996年6月,脉管性疾病的ISSVA分类被参加罗马会议的成员接受。在Mulliken和Glowacki分类和ISSVA分类的基础上,学者们根据最新的研究成果,不断提出修改和补充意见。1993年,Jackson等根据影像学资料和血液流体力学原理,将脉管畸形分为高流量畸形(high-flow malformations(动脉畸形、动静脉畸形和低流量畸形(low-flow malfor-mations(静脉畸形、淋巴管畸形2类,并提出了相应的治疗方案,迄今仍有临床指导意义。199