一种利用扫描电镜观察植物样本表面结构的实用方法

1、1997年3月第20卷第2期四川师范大学学报(自然科学版)JournalofSichuanNormalUniversity(NaturalScience)Vol.20,No.2Mar.,1997一种利用扫描电镜观察植物样本表面结构的实用方法张光祥(四川师范大学生命科学技术系成都610066)摘要本文以诱导体细胞胚胎发生的虎眼万年青鳞片外植体为材料,介绍了一种利作双重导电染色取代喷金以节省实验费用,用高锰酸钾取代锇酸对植物材料进行后固定以增强反差并延长耐受观察的时间.实验结果显示,使用该方法可以取得良好的扫描电镜观察效果.对于使用高锰酸钾固定液容易引发的材料碎裂和受杂质污染等问题,本文也介绍了必

2、要的处理办法和避免措施.关键词扫描电镜观察法,导电染色,高锰酸钾固定液,植物样本表面结构0引言4Gennaro(1973)提出了碘化钾-醋酸铅导电染色法使材料不经喷金即可观察,但是这一方法的实际应用并不多见.本文介绍以高锰酸钾和醋酸双氧铀分别取代锇酸和醋酸铅的制样观察法,并对离体培养的虎眼万年青鳞片外植体进行了扫描电镜观察.1-31材料与方法1.1材料的准备材料是在体细胞胚诱导培养基上培养了10d、15d和28d的虎眼万年青鳞片外植体.材料的准备和培养条件见前文.51.2药品配制2.5%戊二醛固定液:取25g蔗糖放入100mL磷酸缓冲液(0.2mol,pH7.2)中,溶解后取18mL将2mL2

3、5%的戊二醛稀释10倍.剩余的磷酸缓冲液用于冲洗样品.3%KMnO4固定液:取3gKMnO4溶于100mL磷酸缓冲液(0.2mol,pH7.2)中.碘化钾溶液:取20gKI溶于蒸馏水中,溶解后再加0.2g碘(),最后用蒸馏水定容至100mL.醋酸双氧铀溶液:取0.5g醋酸双氧铀溶解于25mL50%乙醇中,搅拌10min后静置,第二116四川师范大学学报(自然科学版)20卷天取上清液使用.1.3制样方法样品经2.5%戊二醛固定液前固定4h以后用含糖磷酸缓冲液漂洗至无戊二醛味为止.用3%高锰酸钾液在4下后固定12h(过夜).然后样品用磷酸缓冲液漂洗至停留10min仍无红色析出为止.接着用碘化钾水溶

4、液处理30min,此后样品经15%、30%、50%梯度乙醇脱水.并用醋酸双氧铀溶液处理30min,经50%乙醇漂洗4次后继续用70%、85%、95%、100%、100%梯度乙醇脱水.从后固定到70%乙醇脱水都在4下进行,所用溶液都在4冰箱内预冷.脱水后经醋酸异戊脂置换10min,在HCP-2型临界点干燥器中干燥处理60min,然后用JHS-840型扫描电镜观察.同时也按常规制样法作了喷金观察.2结果与分析按前述制样方法制得的样品在15kV的加速电压下观察可以取得良好效果.从附图看,虎眼万年青体细胞胚胎发育的几个典型时期如球形胚(图1)、子叶分化期(图2)以及子叶期(图1)都清晰可见.只是作导电

5、染色的样品经60min的观察过程后图象明显变暗(图3).但是在40min内与喷金样品(图4)相比,图象反差和清晰度的差异并不大.导电染色的好处是可以边解剖边观察.在体视解剖镜下把一个子叶分化期体细胞胚着生处的外植体表皮层小心剥去,发现该胚的胚柄消失在外植体的表皮下薄壁组织中(图2).我们在培养初期的外植体切片观察中发现,一些较大的薄壁组织细胞内含有数目不等的颗粒状储藏物(图5、图5a).在扫描电镜观察时把样品小心断裂开来观察断面,发现这些储藏物呈球形、椭圆形等形状,大小不一,一般在12 m至25 m之间(图6、图7).据初步调查,民间有人用虎眼万年青叶子捣碎后外敷医治跌打损伤,至于这种作用是否

6、与上述颗粒状储藏物有关,还有待进一步研究.在戊二醛之后用高锰酸钾取代锇酸作双重固定,以及用导电染色取代喷金,是该方法的两个显著特点.高锰酸钾能很好固定细胞壁、膜系统和磷脂质、糖脂质物质,同时兼有导电染色作用7.将高锰酸钾用作对材料的后固定,既可以增强导电反差,又可以减轻对含蛋白质结构的破坏,还不会出现单独应用高锰酸钾溶液作固定液所见的导电反差太强的现象.高锰酸钾的渗透力远比锇酸强,更适合于固定大块材料.本实验的结果显示,高锰酸钾完全可以作为后固定处理的固定剂用于植物材料表面结构的扫描电镜观察和研究.但是,高锰酸钾是非常强的氧化剂,在氧化还原反应中要被还原成MnO2沉淀,很容易污染样品表面.高锰

7、酸钾还会使样品变硬、极易碎裂,处理不当还会使样品出现众多的小裂纹.通过以下措施在很大程度上避免了上述问题的发生:(1)高锰酸钾固定后要避免液面、瓶壁等部位的MnO2沉淀污染样品,要充分漂洗样品;(2)在后固定至第二次导电染色期间小心操作、防止样品在溶液中翻滚或碰撞;(3)应用丙酮作为脱水剂可以有效地降低样品的脆性.6由于高锰酸钾是强氧化剂,要破坏蛋白质的 -螺旋和四维结构,所以不能用于固定和分析以蛋白质为主要成份的结构.导电染色一般用于生物材料超薄切片的透射电镜观察,利用导电染色取代喷金在植物样品的扫描电镜观察中还很少使用.1-3实验中我们发现用导电染色取代喷金以后,图象反差不够,缺乏层次.然

8、而改用高锰酸钾溶液对材料进行后固定时,图象质量有了显著改善,而且可以,6第2期张光祥:一种利用扫描电镜观察植物样本表面结构的实用方法117钾和醋酸双氧铀作双重导电染色以取代喷金配合以高锰酸钾溶液对植物材料进行后固定可以取得良好效果.这种方法不仅省略喷金手续,节约实验费用,而且还可对样品进行解剖和逐层观察.118四川师范大学学报(自然科学版)20卷图1一个发生于肿块样突起物内的子叶期胚(CE)正在向外生长,在其边缘产生了一个球形胚(GE).图2一个子叶期胚具有宽大的子叶(C),可见一个胚柄样结构(SL)消失在薄壁组织中.图3作导电染色的样本在15kV下连续观察60min后扫描电镜图象已显著变暗、

9、反差减弱.图4喷金后观察的对照样品扫描电镜图象,示成熟期体细胞胚具有一宽大子叶(C).图5一些薄壁细胞含有很多小颗粒.图5a示这些小颗粒在光镜(OlympusBH-2型)高倍镜(DPlan40)下呈球状晶体样结构,具反光特性.图6样品断面的扫描电镜图象显示薄壁细胞普遍含有数量不等的颗粒状储藏物.图7图6的局部放大,示一个细胞内最多含有近20个形状不一、大小不等的颗粒状储藏物.参考文献2582LarryH.AmericanJournalofBotany,1996,83(11):1471-14873YasuhikoE,HiroyoshiO.AmericanJournalofBotany,1996,

10、83(8):955-8604PanessaB,GennaroJJr.ScanningElectronMicroscopy.Chicago:IITRIpress,1973.395-4035张光祥,鲍晓明,何孟元.四川师范大学学报(自然科学版),1994,17(3):52-5651STRUCTUREOFPLANTSAMPLEWITHSCANNINGELECTRONMICROSCOPEZhangGuangxiang(DepartmentofLifeScienceandTechnology,SichuanNormalUniversity,Chengdu610066,Sichuan)AbstractIn

11、thepaperapracticalmethodofinvestigatingsuperficialstructureofplantsamplewithscan-ningelectronmicroscope(SEM)wasdescribedandshoweditsvalidityintheobservationofdevelopmentpro-cessofsomaticembryoderivedonbulb-scaleexplantsofOrmithogalumcaudatum(Ait.).Itisthetechnicalpointthatthegoldsputter-coatingwasreplacedbydoubleconductancestaininginsuccessionwithiodideofpotassiumanduranglacetatetoeconomizetheexperimentexpenditure,andthefixingagentOsO4wasre-placedwithKMnO4forenlargingcontrastofSEMmicrographandprolongingtheperiodofsustainingobser-vationofsample.Somerequisitemeanswerep