抵抗素(人)酶联试剂盒操作手册

1、抵抗素（人）酶联试剂盒操作手册 (测定范围:0.06252ng/ml) 产品介绍和操作概要抵抗素是从小鼠体内新分离出来的信号分子，现已证实抵抗素这种激素因子与2型糖尿病引起的肥胖相关。抵抗素属于新近发现一个小蛋白家族的成员，这个家族的蛋白氨基酸序列中富含半胱氨酸，且多为分泌型蛋白（1，2）。抵抗素仅在脂肪组织中表达，并在3T3-L1细胞分化成成熟脂肪细胞的过程中含量明显降低（1）。啮齿类动物实验结果表明，抵抗素在遗传型肥胖和过量饮食导致的肥胖个体中均呈高表达，而在服用噻唑烷二酮类（TZDs）降糖药后，水平下降。另外，抵抗素可引起机体葡萄糖耐受能力的降低，而对机体进行此蛋白的激素免疫中和实验后可

2、提高胰岛素的效应。因此，现一般认为抵抗素水平与肥胖和胰岛素抵抗有相关。康肽生物科技（北京）有限公司推出的人抵抗素酶联试剂盒可用于测定人的血清/血浆、脂肪细胞或条件性培养基中抵抗素的浓度。试剂盒中的酶标板是包被了抗人抵抗素捕获抗体，且封闭了非特异性结合位点的预包被孔板。样品或标准品中的人抵抗素可被孔板中的捕获抗体捕获结合。在洗去未结合的蛋白后，加入生物素标记的识别抗体，它能够识别并结合孔中已被免疫固定的人抵抗素。再经过浸洗将非特异结合的识别抗体洗去后，先后加入底物的催化剂亲和素辣根过氧化物酶（SA-HRP）和底物溶液（TMB）。最后加入终止液终止酶底物反应。孔中显示的颜色深浅与标准液或样品中人抵

3、抗素的含量成正相关。因此，用若干已知浓度的人抵抗素标准品可以绘制出标准曲线，样品中胰岛素的含量可以根据曲线来确定。样品适用范围血清、血浆、培养基、组织匀浆液、CSF、尿液或其他生物液体。样品中抵抗素的浓度应在试剂盒可测试的范围内。注意康肽生物科技（北京）有限公司承诺：本操作手册的内容信息与所提供的试剂盒产品一致。客户在购买前应根据实际需要考虑试剂盒是否符合要求。 试剂盒组成将试剂盒里所有试剂保存于28。请勿冷冻保存。120×实验缓冲液 1瓶（50ml）2预包被人抵抗素抗体的微孔板 1个3人抵抗素标准品 1管（40ng）4生物素标记抵抗素抗体 1管（15l）5亲和素过氧化物酶（HRP）

4、 1管（20l）6显色底物（TMB） 1管（12ml）7终止液（2N HCl） 1管（15ml）8醋酸纤维素封板膜（APS） 3张其他材料和试剂实验还需自备以下材料和试剂：-微量移液器和移液吸头-96孔板洗板机或手工操作洗板排枪-纸巾或吸水纸-可以检测450650nm范围内吸光度的酶标仪-封闭性较好的容器（15ml或更大的试管）试剂的准备：11×实验缓冲液。用950ml dH2O将20×的实验缓冲液稀释成1×。1×实验缓冲液用于浸洗微孔板，也可用来稀释试剂盒中所有的试剂。若储液瓶底出现结晶，可将其放入37水浴中使结晶充分溶解后再进行稀释。稀释好的1

5、15;实验缓冲液4保存。2生物素标记抗体。用15l 1×实验缓冲液重溶生物素标记抗体粉末，漩涡振荡，使吸附在管盖和管壁上的粉末充分被溶解。用前用实验缓冲液按1：1000稀释成工作液。3亲和素过氧化物酶（HRP）。离心将管壁和管盖上的液体甩下，用前用实验缓冲液按1：2000稀释成工作液。标准液的制备1 在人抵抗素重组蛋白标准品管中加入1ml 1×实验缓冲液，摇匀后室温下至少放置10分钟使粉末充分溶解。用之前摇匀离心。储液的浓度为40ng/ml。2 按照以下方法配制标准液：标准管号标准液体积实验缓冲液浓度储液粉末1000l40 ng/ml150l储液950l2 ng/ml2 5

6、00l1500l 1 ng/ml3 500l2500l ng/ml4 500l3500l0.25 ng/ml5500l4500l 0.125 ng/ml6500l5500l 0.0625ng/ml试剂盒操作步骤：1 进行操作前请仔细阅读本操作手册。将所有试剂恢复到室温后（2030）后再进行操作。2 将预包被的微孔板从密封锡箔袋中取出，将本次实验不需要的板条卸下，装回袋中封好，放回28保存。3 每孔加入100l准备好的人抵抗素标准品溶液，从6开始，顺次加到1（与稀释时管号相反顺序）,另选两孔作为空白孔，其中加入100l的1×实验缓冲液。4 样品孔中每孔加入100l稀释好的样品溶液。5

7、用封板膜将孔板封好，室温条件下在摇床上慢摇孵育2小时。6 小心撕下封板膜后，将孔中的溶液甩净，每孔加入350l的实验缓冲液浸洗，倒出洗涤液后将孔板反扣在干净纸巾上，控干残液。重复洗涤5次。7 每孔加入100l生物素标记抗体。将孔板用封板膜重新封好后，置于室温摇床上慢摇孵育2小时。8 按照步骤6中的操作洗板5次。9 每孔加入100l HRP溶液，封好孔板，室温慢摇孵育30分钟。10按照步骤6中的操作洗板5次。11每孔加入100l底物溶液（TMB），封好孔板，室温慢摇孵育15分钟。12每孔加入100l终止液，反应终止后应立即检测。13在酶标仪上读取450nm各孔的OD值。实验流程简图每孔加入100

8、l抵抗素标准品或稀释样品室温孵育2小时用1×实验缓冲液洗板5次，每孔350l每孔加入100l生物素标记抵抗素抗体室温孵育2小时用1×实验缓冲液洗板5次，每孔350l每孔加入100l HRP室温孵育30分钟 用1×实验缓冲液洗板5次，每孔300350l每孔加入100l TMB，室温孵育15分钟每孔加入100l终止液450nm读取OD值后计算结果结果计算 用对数图表纸绘制标准曲线。X轴表示的为人抵抗素标准品已知浓度的对数范围，Y轴表示和各个浓度相对应的OD值的对数范围。标准曲线正确的表示了抵抗素的浓度与其光吸收值之间的对应关系。标准品浓度越高，孔板中显现的蓝色就越深，

9、相应的OD值也升高。 样品中抵抗素的含量是由其OD值在Y轴上的对应位置决定的，找到Y轴上OD值所对应的点后，平行于X轴方向做水平线，可得到与标准曲线交会的一点。再从这一点做垂直线，与X轴交会处指示的值即为这一样品中抵抗素的浓度值。人抵抗素标准曲线浓度单位：ng/ml保存条件1 收到试剂盒后将其保存于4。产品6个月内保持稳定。试剂盒在使用前应回复到室温。2 1×的实验缓冲液保存于4。3 将当次实验不需用的板条卸下，放入封板袋中封好，4保存。4 将重溶的抵抗素标准品、抗体保存于4，每次仅准备当次实验的用量即可。注意1 建议在实验的当天重溶各种试剂。2 在进行该检测时，未提取的正常人血浆样

10、品应按1：20的比例进行稀释后再使用。3 加入终止液后，应在30分钟内读取OD值。参考文献1. Steppan, C.M. et al. 2001. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409:307-312.2. Steppan, C.M. et al. 2001. A family of tissue-specific resistin-like molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:502-506.3. Way, J.M. et al. 2001. Adipose tissue res