EMS诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用精

1、农作物化学诱变育种是人为地利用化学诱变剂，诱发作物发生突变，再通过多世 代对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上能利用的作物新品种。化学诱变具有成本低廉、使用方便、诱变作用专一等特点，是一种迅速发展的农作物育种手段。目前，在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯（EMS被认为是应用最好的诱变剂16。EM S诱变技术在国内外已成为一种成熟的技术，在玉米诱变育种中得到广泛的应用。1EMS诱变技术EMS，即甲基磺酸乙酯，是一种烷化剂，烷化剂EM S所诱发的突变主要通过以下 步骤来完成。烷基化位点主要在 G （鸟嘌呤的N-7位上6,由于G上N-7的烷基化,使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季铵基

2、团产生两个效应：一是促进第一位氨基上氢解离，使G不再与C配对而与T配对,从而造成G:C-A:T转换（图1。二是N-7成为季铵基团后，减弱了 N-9位上的N-糖苷键，而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，则在无 碱基位置上可以通过插入任何一个碱基，在第二轮复制以后，则原来的G : C对可以 变为任何碱基对G : C、C : G、A : T、T : A ,既有转换，又有颠换（图2。此外,它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生 染色体的缺失6（图3。EMS诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用安伟,樊智翔，

3、马海林,米小红,王计虎（山西农业科学院玉米研究所，山西忻州034000摘要:综述了 EMS的作用机制、作用特点及EMS在创造玉米新种质中的应用等方面的内容，并对EM S在玉米遗传育种研究中的利用前景进行了论述。关键词:EM S ;诱变技术;玉米;新种质中图分类号：S513.032文献标识码:A文章编号：1002-2481(200812-0037-03In duced Mutati on Tech nique and App licati on of EMS toCreate New Corn Germpl asmAN Wei ,FAN Zhi-xia ng ,MA Hai-li n ,MI X

4、iao-ho ng ,WANG Ji-hu(Maize Research In stitute ,Sha nxi Academy of Agricultural Scie nces ,Xin zhouSha nxi ,034000,Ch inaAbstract:The mechanism、property and application of EMS for creation of new corn ger mp lasm etc.was reviewed in the pap er.The prospect of EMS utilizati on in research of corn ge

5、n etic and breed ing was also poin ted out.Key words:EMS ;ln duced Mutatio n Tech nique ;Cor n ;New ger mp lasm*收稿日期:2008-11-13作者简介:安伟(1975-,男，山西代县人，助研，主要从事玉米遗传育种工作。Journal of Shanxi Agricultural Scien ces山西农业科学2008,36(12:3739图1N-7烷基化鸟嘌呤由于N-1位上H的电离而与胸腺嘧啶配对，从而导致G:C-A:T转换图2N-7烷基化鸟嘌呤通过去嘌呤作用导致转换和颠换37图3烷

6、化剂诱导染色体缺失模式Hake等人采用分子遗传学手段,验证了 EM S诱导的8个稳定玉米乙醇脱氢酶 adh突变体均为点突变9。 Burns等报道在EM S诱导的184个大肠杆菌突变都是 单个碱基对改变，其中183个G : C变为A : T7。 Lebkowski研究表明EM S诱导的人类54个突变中有53个也是由G : C变为A : T8。这表明EMS诱导的突变主 要是点突变。2EMS诱变的特点2.1诱变效率高EMS化学诱变产生的点突变的频率相对较高，而染色体畸变相对较少，生理损伤小。因而可被用来对玉米的某一特殊性状进行改良，并且容易出现高产、质优的突 变体3。若引起染色体的损伤，主要是染色单

7、体断裂，且断裂后不再连接起来6 02.2诱变频率高Bird报道用EMS处理玉米花粉，突变频率可高达78%。并且与其它诱变剂相 比,EMS诱变后产生的显性突变体相对较多1，因而易于进行突变体筛选。2.3诱变范围广诱变范围广，出现的突变体类型较多。虽然烷化作用主要引进的是 G : C、A : T碱基对之间的转换，但是同时也可出现其它各种类型的突变体，因而具有多效性。3EMS在创造玉米新种质中的应用在众多的化学诱变剂中，EMS作为作物最有效的化学诱变剂之一，早在60年代EM S就被用于玉米诱变育种10。当时是用EMS水溶液处理玉米种子,Cornu,et al. 用EMS处理感染小斑病的法国自交系种子

8、，而后把M代正在发芽的种子放在小斑病菌液上生长，或用小斑病菌液喷洒幼苗，两个处理 均筛选出了抗性个体1。一般来说,EMS水溶液处理玉米种子效果较差。这是因 为:(1EMS与水起作用产生不起诱变作用但有毒的化合物：甲磺酸和乙醇(CHSO2OC2H5+H2O-CH3SO2OH+C2H5OH,甲磺酸显著的引起植物损伤和不育；(2胚细胞在成熟的种子中被许多有生命的细胞包围，再加上细胞膜的双透性就阻碍了 EMS进入胚细胞;(3产生的突变基因难固定致终，种子的胚细胞在分化出配子体以后，要经过无数次 的细胞分裂和分化，一些突变因子在染色体无数次的复制过程中不易表达而丢失11。此外，种子处理易产生嵌合体，要筛

9、选的诱变后代群体大，显性突变在M代表现，隐性突变在M代才能表现出来，得到稳定突变体所需的时间长。Coe于1966年发现玉米花粉可以在石蜡油中悬浮几个小时仍保持生命力，把它们涂到花丝上，仍能正常授精结实。后来 Neuffer将此发现加以引伸，进一步把化学 诱变剂悬浮于石蜡油中，而后与玉米花粉混合进行诱变，获得成功。经过以后不断改进和完善，现在这项技术已经成为玉米诱变育种的主要手段。1986年，美国ICI种子公司Greaves等用EM S的石蜡油溶液处理玉米自交系的成熟花粉40min,在M2代用除草剂进行筛选，获得9株抗除草剂普杀特（Pursuit突变体，其中反应最佳的植株可 以忍受10倍除草剂致

10、死剂量。该基因为抗除草剂显性基因，命名为IT（lmazethapyrTolerant,并申请专利保护。1991年ICI公司首次推出含IT抗除草剂基因的玉米杂 交种。因它不属于转基因玉米，不存在转基因产品的安全性问题，所以市场反应良 好。当年该种子销售额达250万美元,1992年突破1000万美元。1987年该公司用 此方法获得糯质突变3个、甜质突变3个，突变率均为0.12%5。1991年张铭堂利 用EM S处理玉米花粉，发现糯质基因WX的诱变频率为0.12%。1992年AllenWright（依阿华大学用EM S处理B73的花粉从M3后代中选出10个高赖氨酸、8 个高蛋白、7个高油、4个高亚油

11、酸、3个高油酸和9个低棕榈酸材料。VictorRoboy（蒙坦拿大学从EM S花粉诱变后代中选出两个高油突变体5。Neuffer采用 该方法获得大量突变体，仅经过仔细研究并进行基因定位的就有 760个。这些表明EMS花粉化学诱变技术已获得成功，并且已在国外得到应用。国内一些育种单位目前已经认识到 EMS花粉诱变技术的重要性，相继开展了这方面的工作。郭丽娟等人（1987用EM S处理玉米八趟白单倍体胚性细胞无性系 以玉米小斑病菌毒素为选择剂获得了抗玉米小斑病突变体。刘治先 （1998用EMS 花粉诱变技术筛选出两类高油酸玉米突变体，10个高赖氨酸、8个高蛋白、7个高 油、4个高亚油酸突变体，为特

12、用玉米育种和遗传研究提供了可贵的材料。赵永亮（1998对花粉诱变快速创造特用玉米新种质这一现山西农业科学2008年第36卷第12期38代生物学技术进行了研究。结果表明，化学诱变在两个世代就可创造迄今为止 所积累的所有特用玉米类型，包括白玉米、甜玉米、糯玉米、超甜玉米和高直链淀 粉玉米。薛守旺（1998采用同样方法处理了 6个稳定玉米自交系的成熟花粉，结果得到浅黄粒突变体、母株穗发芽突变体、显性核不育突变体和sulsul甜玉米。EMS化学诱变可诱发每一个基因位点发生突变，这样不仅可创造出在育种中有 用的新的突变种质资源，而且有可能产生生物学上有用的突变体，它们虽然不能产生 直接的经济效益，但是可

13、以利用它们对生物进化过程中曾经出现过的遗传变异进行全面检索和研究，为玉米生长发育等基础性研究提供一些合适的素材。Hoisingto和Neuffer在EM S玉米花粉处理后代中都发现了病斑突变体，这类突变体在不受病原 菌侵染的条件下出现病斑，它们似乎是将控制抗体产生的遗传机制打开，导致基因开 始起作用。通过研究，使人们对病症表达过程中寄主作物所起的作用有新的认识。1988年,Shozo Fujioka利用5种单基因矮化玉米突变体，研究了赤霉素的合成途径，为 后人认识激素的作用机理，尤其是从分子角度来理解激素的反应途径提供了重要依 据。M iles等人通过对EM S诱导的hcf突变体的研究，从而使

14、人们加深了对光反应过程中电子传递的遗传控制的理解。此外，EM S诱导的突变体在淀粉和蛋白质合成、光合作用过程、植物发育过程的研究过程中，都起了很大的作用。4EMS的应用前景4.1对诱变后代进行分子生物学研究近年来，随着分子遗传学研究的深入，为EM S在作物遗传育种上的应用研究开辟了一条新的途径。运用DNA分子标记对EMS诱变后代进行分析，不但能鉴定出 肉眼鉴别或仪器分析无法鉴别的突变，而且使对突变性状的遗传研究和定位变得更 加方便和有效，同时可据此绘制相应的基因图谱，并在分子水平上对突变热点与突变 机理进行分析。目前，这方面的研究报道还很少。因此，在我国开展DNA分子标记 技术与诱变技术相结合

15、的研究，将具有重大的理论价值和现实意义。4.2对诱变后代进行抗除草剂的筛选由于突变几乎影响到玉米形态的每一个方面所以采用化学诱变可以诱发各种突变。虽然化学诱变是不定向的，但是只要对诱变后代群体加以适当的选择条件，就可能获得所需 的有经济价值的新突变。随着分子生物学研究的发展，抗除草剂作物已引起人们的广泛关注。当前，玉米上应用的除草剂如阿特拉津、乙阿合剂等均为选择性除草剂，它们的除草谱较窄，对有些杂草杀灭效果差；对喷药时期要求严格，一旦错过喷药的适宜时期则除草效果锐 减;药剂施用成本高。在21世纪，高效、灭生性除草剂的开发将成为除草剂开发的主 流,特别是几十年来长盛不衰的有机磷除草剂草甘磷将得到

16、广泛的应用。针对广谱、灭生性除草剂研制出抗除草剂玉米已 经成为国际玉米杂交种发展的方向，在美国玉米市场上有近半数是抗除草剂品种，而 我国目前还没有抗除草剂玉米问世，也未见国内有这方面的研究报道。借鉴国外的经验对EMS处理的M群体进行抗除草剂草甘磷筛选，以期筛选出抗除草剂突变体。对抗性基因进行分子生物学鉴定后,通过回交或其他生物技术转入玉米杂交种，可望创造出具有重大经济效益和社会 效益的育种材料和杂交种。参考文献:1Bird,R.M ck.,a nd M.G.Neuffer.l nduced mutatio ns in maize.l nJJa nick(ed. Plant Breedi ng

17、Reviews(5J.New York:Va n Nostra nd Rei nhold, 1987,139-180.2马惠平，赵永亮,杨光宇.诱变技术在作物育种中的应用J.遗传,1998,20(6:41-43.3史桂荣.化学诱变剂在玉米育种上的应用J.黑龙江农业科学,1994,(6:44-46.4朱保葛，路子显,耿玉轩，等.烷化剂EM S诱发花生性状变异的效果及高产突变系的选育J.中国农业科学，1997,30(6:87-89.刘治先.玉米育种技术J.玉米科学,1995,3(4:12-15.张铭堂.诱变J.科学农业,1996,44(1,2:37-52.7 Burns ,P .A.,F L.AI

18、Ie n,a nd B.W.GIickma n.DNA seque nee an alysis ofmutage ni city and site sp ecificity of ethly metha ne sulfo nate in Uvr and UvrB strai ns of E.ColiJ.Ge neties,1986,113:811-819.8 Hake,s.,w.c.Taylor,a nd M.Freeli ng.M olecular an alysis of gen etically stablemuta nts of the maize Adhl gen eJ.M ol.Ge n.Ge net,1984,194:42-48.9 Lebkowski,J.S.J.H.M iller,a nd M.P .Calos.Determi nati on of DNA seque nee cha nges in duced by ethyl metha ne sulfo