黄酮类化合物

1、. . . . 1绪论黄酮类化合物的生理作用一直受到人们的关注。早在20世纪30代，就有学者发现黄酮类化合物具有维生素C样的活性。Pratt研究认为，黄酮类化合物具有一级抗氧化剂的作用。随着全球人口老龄化的加剧，老年性疾病的防治和抗氧化、抗衰老研究已引起广泛关注，评价和筛选富含黄酮类化合物的植物资源已成为农学、医学和食品科学研究的热点之一。甘草是我国传统常用中草药之一，也是我国重要的植物资源。甘草黄酮类成分是甘草中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、增强心血管功能、增强免疫力等作用。因此，开展甘草的深加工，使甘草资源得以充分利用，增加资源的附加值，前景十分可观。1.1甘草研究概况1.1.

2、1甘草简介甘草(Glycyrrhizae radix,GR)又名甜草根、粉草、灵通、国老等，为豆科甘草属多年生草本植物。甘草株高4080cm，根茎粗壮，具有地下匐枝，主根圆柱形，长达12m，外皮红褐色至暗褐色，横断面茎部淡黄色或黄色，有甜味，茎直立，密被白色短毛与刺毛状腺体，羽状复叶，具小叶717片，卵形、圆形，长1 3cm，宽1 2.5cm，总状花序腋生，花密集:花冠蝶形，淡蓝紫或紫红色，长1425mm。荚果条状长圆形、镰刀形或弯曲成环状，褐色，外面密被刺状腺体与短毛，种子为28粒，扁圆形或肾形，黑色，花期67月，果期79月。我国药典记载药用甘草为乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草的干燥根与根茎

3、。甘草归心、肺、脾、胃经1，从古至今，广为药用。1.1.2甘草的功效，药理药效作用人类应用甘草有近2400年的历史，我国医籍文献记载甘草最早见于神农百草经，列为上品，称有强坚筋骨、长肌肉、倍力气和解毒之功，能治五脏腹寒、热邪气与金疮肿，东汉医圣仲景(公元2世纪)在其伤寒论中使用处方74%有甘草。梁朝名医弘景(公元5世纪)编著的名医别录中称其为“美草、蜜甘、国老”，并冠以“众药之王”的称号。明朝时珍在其本草纲目中把甘草放于1074种中药的第一味，收录于12卷之首。清朝吴其俊在他的植物名实图考中，对甘草亦有较详细的考证。本草正中写道“甘草得中和之性，有调补之功，故毒药得之解其毒，刚药得之和其性，表

4、药得之助其外，下药得之缓其速。随气药入气，随血药入血，无往不可，故称“国老”4。种植甘草中的甘草酸与黄酮提取纯化工艺研究甘草经我国传统医学长期临床实践验证，确认其有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，可用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽多痰、腹腔和四肢疼痛、痈肿疮毒等症，并用之缓解其它药的毒性。甘草还具有抗寒、耐热、耐旱、抗盐碱、喜光等优良特性，适生性强、生命力旺盛，为干早地区的植物资源之一。50年代以后，各国学者对甘草进行了较为深入的研究，随着研究的深入和新技术的不断应用，人们对甘草的认识和应用也愈来愈广泛。甘草不仅广泛应用在医学上，而且应用于食品、卫生、轻工方面

5、。还具有防沙固沙、改良土壤等作用，在环保方面，防止水土流失与改良生态环境4-7。1.2国外甘草有效成分研究进展1.2.1甘草的化学成分近年来，国外学者对甘草的化学成分作了大量的研究。在甘草中己发现和确定化学结构的化合物类型有三萜皂昔、黄酮、香豆素、甾醇、生物碱、挥发油、有机酸、搪类、氨基酸等，其中三萜皂苷类和黄酮类是其主要成分，详见综述8-10。黄酮类的代表化合物有甘草素(liquihtigenin，LG)、异甘草素(isoliquiritigenin,ILG)、甘草苷(liquiritin，LN)、异甘草苷(isoliquiritin，ILN);甘草酸(又名草甜素，glycyrrhizic

6、acid，GA)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GTA)则是萜类的代表化合物。它们的结构见图1.111。1.2.2甘草黄酮类化合物的种类黄酮类化合物(Flavonoids)，又名生物类黄酮化合物(Bioflavoinoids)，亦称维生素P，是自然界中存在的酚类物质，常与维生素C伴存，属植物次级代产物。在1952年以前黄酮类化合物主要是指基本母核为2一苯基色原酮(见图1.2)的一系列化合物。现在黄酮类化合物泛指两个苯环(A和B)通过中央三碳链连，即具有C6一C3一C6基本母核(见图1.3)的天然产物，其中C3部分可能是脂链，可能与C6部分形成六元和五元氧杂环。根据中央三碳链

7、的氧化程度、B环(苯)连接位置(2一或3一位)以与三碳链是否构成环状等特点，可将甘草中黄酮类化合分为黄酮类、异黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢异黄酮、查尔酮类、二氢查尔酮类等。据现有资料报道:迄今为止，国外己从甘草中分离鉴定出300多个黄酮类化合物13。1.2.3甘草黄酮类化合物的药理学研究大量研究显示，黄酮类化物具有抗菌、抗病毒、抗发炎、抗过敏以与抗血管舒等作用;另外，它还能抑脂质过氧化、血小板凝聚、毛细管渗透性以与脆性;黄酮类化合物的此类效果都与它的抗氧化性相关。甘草属植物中的黄酮类成分具有抑菌14,15、抗真菌16、抗肿瘤、抗诱变、抗病毒等广泛的药理作用。(1)抗肿瘤作用

8、药理学研究表明，甘草中异黄酮类物质具有植物雌激素活性，可以抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞的增殖27，而其他的黄酮类物质如甘草黄酮则不具有这类雌激素活性。甘草查尔酮也可抑制癌细胞的生长28。也有研究显示，二甲苯并蒽（DMB）类甘草黄酮可以消除致癌物质，从而达到预防癌症的功效29。我国学者马靖等17报道了甘草提取物通过P53非依赖途径诱导胃癌MGC一803细胞凋亡;其作用机制是钙池排空操纵的外钙流在甘草诱导MGC一803细胞凋亡之中发挥了决定性的作用18。马靖等19还报道甘草提取物除可诱导胃癌MGC一803细胞凋亡之外，还可选择性诱导肝癌HepG2、肺癌NSCLC与宫颈癌Hela等几种人肿瘤细胞凋亡

9、。(2)抗HIV病毒日本人奥田拓男教授与宫本宽治助教报道，甘草中有3种黄酮成分对艾滋病病毒的增殖抑制能力为甘草甜素的25倍。现代药理研究表明，甘草素与异甘草素的抗HIV病毒的能力更高，引起国外广泛注意20。甘草吡喃香豆素等多种甘草黄酮类成分可抑制HIV诱导的巨细胞形成，且未见细胞毒性。甘草查尔酮A在浓度为20mg·L-1时，能抑制HIV诱导的巨细胞形成21。(3)抗病原微生物作用甘草黄酮类化合物中抗菌成分较多，作用较强。甘草根中最常见的单体成分甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素对新城艾滋病毒有抑制作用。另外，甘草黄酮还有抗心率失常作用;最近，我国学者胡小鹰等22研究结果表明，甘草总黄

10、酮具有抗心率失常作用。从以上资料可以看出，国外学者对甘草黄酮类组份药理活性研究已取得很多有价值的成果，充分说明了甘草黄酮是一类值得深入研究的有效成分。相信，在不久的将来，甘草黄酮类成分一定会作为一类高效低毒的天然药物得到广泛应用。(4)抗氧化作用甘草中黄酮类成分普遍具有抗氧化活性，可以作为自由基清除剂22。甘草黄酮类物质可以防止低密度脂蛋白(LDL)发生脂质过氧化反应，降低病人血浆中的低密度脂蛋白被氧化的易感系数，提高血浆中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝集、抗滞留的能力23，可以用来治疗各种由于血脂高、脂质氧化所引起的疾病。甘草查尔酮B，D强烈地抑制过氧化阴离子，并显示了对DPPH自由基的清除活性

11、24。甘草黄酮类化合物中的查尔酮和二氢黄酮，均为含有酚羟基的化合物，其对脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）的生成具有明显抑制作用，对超氧阴离子自由基和羟自由基有明显的清除作用。甘草总黄酮对Fenton反应生成的羟自由基具有较强的直接清除作用，效果明显优于甘露醇，其清除羟自由基的IC50是甘露醇的1/255，其抑制羟自由基生成的IC50是甘露醇的1/13925(5)保肝作用甘草黄酮可缓解CCl4引起的小鼠血清中血清谷丙转氨酶(GPT)与乳酸脱氢酶(LDH)活性的增高。CCl4经肝微粒体酶细胞色素P450激活后生成·CCl3，·CCl3可攻击肝细胞膜上磷脂分子，引起脂质过氧化或与

12、肝微粒体脂质和蛋白质发生共价结合，损伤肝细胞膜结构与功能的完整性，从而使胞浆可溶性酶渗入血液中。甘草黄酮可能由于保护了CCl4所致的肝细胞损伤，减少了GPT与LDH渗入血液，从而降低CCl4中毒小鼠血清GPT与LDH活性。研究表明甘草黄酮可以明显抑制小鼠肝脏MDA增高和还原性谷胱甘肽的耗竭，其作用呈一定的量效关系，电镜检验表明甘草黄酮可保护乙醇所致的肝细胞超微结构的损伤；并且能抑制肝组织脂质过氧化、提高小鼠肝脏SOD活性，减少肝组织脂褐素形成42，这一作用与甘草黄酮清除由酒精激活产生的氧自由基有关。甘草黄酮是一类生物活性较强的成分，近年来的研究表明，它对脂质过氧化终产物丙二醛的生成有明显的抑制

13、作用，能有效地清除体产生的O、OH等自由基，从而阻断脂质过氧化反应的增殖。(6)对消化系统的作用甘草黄酮对多种溃疡模型引起的药物性溃疡均有明显抑制作用，已作为消化性溃疡药收入日本医药品集中，其抗溃疡作用的甘草黄酮单体是：甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素等。仁等从提取甘草膏剩下的药渣中得到富黄酮组分，已被我国批准用于治疗溃疡病的二类药物；最近贾世山也证明甘草叶乙醇提取物的富黄酮组分具有显著抑制胃酸分泌过多的作用43。(7)抗菌作用据研究报道，甘草黄酮化合物甘草查尔酮A、甘草查尔酮B、光甘草定、光甘草素等对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用相当于链霉素，对酵母菌和真菌抑制作用高于

14、链霉素，但对大肠杆菌和绿脓杆菌抑制作用远低于链霉素44。甘草查尔酮A体外对革兰氏阳性球菌、杆菌和棒型菌有明显的抑制作用，其最低抑菌浓度为0.3g/mL8g/mL45。(8)抗心律失常作用胡小鹰等46研究结果表明，50 mg/kg100 mg/kg甘草总黄酮可延长乌头碱诱发的小鼠心律失常潜伏期，减少氯仿诱发的小鼠心室纤颤阳性律；25mg/kg50mg/kg甘草总黄酮可增加喹巴因诱发豚鼠出现室性早搏、室速、室颤和心搏停止所用剂量。由于甘草黄酮类对乌头碱诱发的心律失常有明显拮抗作用，提示有效成分可能为异甘草素。甘草黄酮能够对抗乌头碱、BaCl2、冠脉结扎、CaCl2Ach混合液、氯仿、喹巴因诱发大鼠

15、和小鼠的心律失常47，说明其抗心律失常作用机制是多方面的。(9)抗炎和抗变态反应作用前联学者研究表明，甘草香豆素有较强的消炎和抗变态作用，比磺胺和抗生素的药效好。日本学者Shibata等从甘草中分离得到有抗炎活性的黄酮类成分甘草素。另外，从甘草中分离到的甘草查尔酮A对十二氧十四烷酰大戟二萜醇醋酸质(TPA)所致肿瘤和炎性水肿均有抑制作用48。甘草中的异甘草苷和甘草苷对透明质酸酶的活性和由免疫刺激所诱导的肥大细胞的组胺释放都有抑制作用。甘草查尔酮A和甘草查尔酮B还可抑制人多形核嗜中性白细胞中白三烯的生物合成，并可抑制该细胞的脱颗49。Yokata等报道从光果甘草中分离到的光甘草定具有明显的抗炎和

16、抑制黑色素生成作用50。(10)对酶的抑制作用研究表明，甘草黄酮类化合物对多种酶具有抑制作用。如异甘草素、光甘草定和甘草西定等黄酮类化合物对环磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)有较强的抑制作用。而黄酮类化合物异甘草苷、甘草苷、甘草素对醛糖还原酶(AR)有抑制作用51。另外Hatano报道了甘草查尔酮A、甘草查尔酮B和异甘草素等数种甘草黄酮类化合物对单胺氧化酶(MAO)有抑制作用。(11)其它药理作用此外，甘草黄酮类物质还有抗衰老的作用，其机制主要与其抗氧化作用有关，对DNA具有保护作用。另外还有报道甘草黄酮具有抗血小板作用，Tawanta等报道，异甘草素具有抗血小板聚集作用，它们的作用强度在体相当于

17、阿司匹林52。Somjen等研究表明光甘草定和光甘草素具有雌激素样作用53。1.2.4甘草黄酮市场应用调查(1)在食品添加剂方面的应用在我国食品添加剂产业的品种结构中，抗氧化剂是最薄弱的一环。尤其是天然抗氧化剂。目前国外共有此类商品47种，甘草抗氧化物的抗氧化效果明显优于BHA和BHT等。到目前为止，甘草抗氧化剂只有一个品种，是类黄酮的混合物。我国食品添加剂使用卫生标准（GB2760）规定：甘草抗氧化剂可用于油脂、油炸食品、腌制鱼、肉制品、饼干、方便面、含油食品，最大使用量0.2g/kg。(2)在保健品方面的应用2001年9月，卫生部下达通知，禁止用野生甘草提取物作保健食品配料，这直接影响了甘

18、草黄酮保健食品的研发与生产。蒙贝尔技术现正生产不同剂型的甘草健喉灵、甘草黄酮茶、甘草黄酮矿泉水、甘草膳食纤维与异甘草素等多种甘草制品。(3)在医药方面的应用目前以甘草黄酮为主要原料的新药产品尚未正式进入市场，对甘草黄酮中某些单体的药理作用与药用价值也只是处于实验研究阶段。目前国只有九惠制药厂生产的安胃疡胶囊取得了国家二类新药批号，主要在、等几个地区销售，年销售额为2000万左右。(4)在化妆品方面的应用市场调查发现54，与1998年的情况相比，目前许多美白、祛斑产品中都添加了天然美白成分，其中使用最多的天然成分是胎盘提取液与甘草提取物或甘草黄酮，如妮维雅美白防护日霜中加有甘草精华；羽西天然润白

19、膏配方中加有甘草精华、葡萄籽提取液、桑树根与天然水藻；雅芳美白系列产品中也含有甘草黄酮、胎盘素；迪奥生产的美白护肤露中同时加入了维生素C，熊果苷和甘草酸盐3种美白成分；奥利天然化妆品生产的瑞草植物润白营养霜含有甘草提取物等。还有夏奈尔、悦儿U.V.White、CD美白专业护肤、嘉娜宝艾丽美白、高丝精纯美白露、美爽爽皙嫩白保养、资生堂UV white、资生堂怀洁皙嫩白露、雅芳美白系列和羽西天然润白霜等美白产品均使用了甘草黄酮或甘草提取物55。2000年2月罗氏公司曾对全球美白产品进行了市场调查，在调查的91个产品中，欧洲占42%，亚洲占28%，南非占20%，拉丁美洲占10%。调查结果显示：目前，

20、应用比较普遍的美白活性成分是氢醌、维生素C与其衍生物、甘草黄酮和紫外线吸收剂等。在中国市场上极具潜力的美白剂包括烟酰胺、皮素拮抗剂和甘草提取物等。因此，甘草黄酮是目前在化妆品中使用较多的天然活性成分之一，有着广阔的应用前景。2003年我国化妆品销售额已超过500亿元人民币，在今后5-10年，也将以每年9%的速度增长，据预测到2010年销售额可望突破1000亿元人民币。甘草黄酮的美白祛斑效果显著，相信在未来化妆市场应该有较好的发展前景。1.3甘草有效成分提取纯化技术现状黄酮类化合物种类很多，多数以甙元的形式存在，少数以游离形式存在。一般情况下，游离的黄酮类化合物难溶于水，而黄酮甙易溶于热水，两者

21、都能溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。易溶 水的要由带糖苷键的黄酮苷类与花色苷组成，而溶于乙醇的要在黄酮苷元类化合物。甘草中黄酮类物质主要以甙类的形式存在，其中主要是糖甙形式。游离甙元含量较低，故甘草黄酮即可用热水提取，亦可用醇提取。目前用于甘草黄酮的提取方法主要有溶剂浸提法、碱提酸析法、酶辅助提取法、超逺辅助法、微波提取法、超临界流体萃取法等，以与多种方法的复合提取法。要介绍几种方法：1.3.1传统回流提取方法甘草黄酮回流提取是目前国外提取甘草中黄酮类物质最为广泛的方法，由于黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂中，所以很多黄酮类物质提取剂研究多采用有机溶剂提取。可用冷浸法或加

22、热抽提法提取，不同有机溶剂对不同植物黄酮类化合物的提取效果具有一定的差异，其中乙醇和甲醇是普遍采用的提取溶剂38l。由于乙醇相对廉价，同时其残留对人机体相对安全，常用70%的乙醇提取天然黄酮产物。但用有机试剂提取存在着较大的安全隐患，操作时需谨慎。1.3.2超声波提取技术超声波提取技术(Ultrasound Extraction,UE)是近年来应用到中草药有效成分提取分离的一种最新较为成熟的手段，利用超声波的振动空化、机械粉碎、搅拌等作用，使植物组织在溶剂中瞬时产生的空化泡崩溃，而使组织中的细胞破裂，利于溶剂渗透到植物细胞部，使细胞中的成分进入溶剂中，加速相互渗透、溶解，以增加中药材中有效成分

23、化合物在溶剂中的溶解39，40，41。炳奇等43l利用超声波法从甘草中提取黄酮，通过对超声功率、超声时间、提取温度与固液比等因素的研究发现最佳提取条件为超声功率I000W，超声时间75min，提取温度40，固液比1:8;最佳提取条件下黄酮含量为3.61%。1.3.3微波提取技术微波萃取技术又称微波辅助提取(Miccrowave assisted Extraction,MAE)是指使用适合的溶剂在微波反应器中从天然药用植物、矿物、动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。微波是指频率为300到300000MHz的电磁波，介于红外线和无线电波之间。微波的量子能级属于德华力(分子间作用力)的畴，与化合

24、物键能相差甚远。美国通过研究认证微波萃取法不会破坏任何被测分析物的分子结构。在微波萃取中，被处理的物质通常是能够不同程度吸收微波能量的介质，整个加热过程是利用离子传导和偶极子转动的机理，具有反应灵敏、升温速度快、效率高等优点。由于吸收微波能，物料部温度突然升高，在天然物料中的维管束和腺胞系统升温更快，保持此温度直至其部压力超过细胞壁膨胀的能力，细胞破裂。位于细胞的有效成分从细胞壁自由流出，传递到萃取溶剂里。另一方面，由于不同物质的tan6值不同，对微波能的吸收程度也不同，微波可以对体系中不同组分进行选择性加热，从而使被萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到萃取溶剂中。微波萃取技术的原理就是利用

25、不同组分吸收微波能力的差异，使基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中，并达到较高的产率。萍，艳等45利用微波从甘草中提取总黄酮，并测定其含量。测得甘草中总黄酮含量为1.721%，平均回收率为98.2%，其提取速度快，实验结果令人满意。1.3.4超临界萃取方法超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,简称SCF)是用超临界流体（简称SCF0作为萃取溶剂，利用其特殊的物理化学性质对混合物进行萃取分离的一种新型技术46。超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流

26、体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的47，48。其优点是：可以在接近室温(35一40)与CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散。由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留溶媒，同时也防止

27、了提取过程对人体的毒害和对环境的污染，是100%的纯天然;萃取和分离合二为一，当饱含溶解物的CO2一SCF流经分离器时，由于压力下降使得CO2与萃取物迅速成为两相(气液分离)而立即分开，不仅萃取效率高而且能耗较少，节约成本:CO2是一种不活泼的气体，萃取过程不发生化学反应，且属于不燃性气体，无味、无臭、无毒，故安全性好;CO2价格便宜，纯度高，容易取得，且在生产过程中循环使用，从而降低成本;压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数。通过改变温度或压力达到萃取目的。压力固定，改变温度可将物质分离;反之温度固定，降低压力使萃取物分离，因此工艺简单易掌握，而且萃取速度快。付玉杰，祖元刚等49利用超临界

28、CO2c02萃取法对甘草黄酮进行提取，发现提取率比常规溶剂法高2.2倍。为工业化SFE一CO2法生产粗甘草黄酮提供了有价值的工艺参数。研究表明，利用超临界CO2方法，在萃取压力30MPa、萃取温度50、原料与夹带剂(85%乙醇)比15g/mL、CO2流量为10k/h、分离压力5.5MPa、分离温度40的条件下，得到的甘草黄酮类物质与其他方法相比较具有很明显的优势。1.3.5酶提取技术由于黄酮类物质被细胞壁包围不易提取，并且常有果胶粘结，因此加入一定量的纤维素酶、果胶酶可以破坏细胞壁结构，使提取传质阻力减小，利于黄酮类物质的释放出51。高保英等52利用纤维素酶果胶酶处理甘草提取甘草黄酮，研究发现

29、复合酶法提取的最佳条件:以纤维素酶、果胶酶组成的复合酶，40，pH5.0的条件下酶解3h，提取率可达1.66%，与微波法提取率相当。酶法提取与微波法提取相比，提取成本低，耗能低，为提取甘草黄酮提供了一种新方法。1.4响应面法简介响应面分析法(Response SurfaceMethodology,RSM)是由Box于1957提出的一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法11,目前已在黄酮、半纤维素、多糖、蛋白质、脂肪酸、生物碱等的提取工艺优化上得到广泛应用12-16。在单因素试验的基础上,利用响应面分析法对甘草酸和黄酮联合提取的主要工艺条件进行了优化,实现了甘草酸和黄酮的同步提取,克服了分步

30、提取甘草酸和黄酮工艺的缺点,可为甘草的进一步开发利用提供技术支持。响应面是指响应Y同一组输入X1，X2,Xn之存在函数关系式Y=F(X1，X2,Xn)，则由Y=F(X1，X2,Xn)所表示的曲面叫做响应面。在应用响应面法时，我们假定：(1)这个存在且输入变量是连结的；(2)函数F在较窄的围可以用一个低阶的多项式逼近；(3)输入量X1，X2,Xn在试验过程中可以控制和度量。响应Y代表三维空间中的一曲面，为有得于目测响应面的开头，常画出响应面的等高线。在等高线图中，每一条等高线对应于响应面的一个特定的高度，它有助于研究导致响应面的形状或高度改变时，输入量X1，X2,Xn的水平。1.5甘草与其有效成

31、分的研究趋势甘草是一味常用的中药。随着其化学成分研究的深入，发现了许多具有药用值的生物活性化合物。随着生物学技术的发展，甘草的研究也从宏观走向微观。既涉与复方应用，又涉与基因分析。有关甘草与其复方药物的药理作用研究已开展较为广泛，但甘草化学成分的微量鉴定与其临床作用机理和效果评价有待进一步研究。随着先进的分离技术不断应用到研究中来，相信还会有更新颖、药用价值更高的先导化合物被陆续分离鉴定出来。将来的发展趋势与研究工作的重点在于:(l)开发甘草的复方药配制，并对其功效进行研究，继续分离研究甘草的有效物质成分，并且研究有效成分的综合药理价值，在临床上试验，然后产业化这些配方和有效成分，扩大甘草的资

32、源利用价值。(2)合理开发已有甘草资源，甘草中的有效物质众多，那么合理利用这些有效物质称为当前的研究重点，甘草的研究重点应该放在人工种植甘草的上面，对野生甘草资源加以保护利用，建立循环利用的合理甘草资源市场。(3)提高甘草资源的深加工项目，消除甘草的初加工的浪费，例如主根部分可以供给切片市场，侧根部分可以进行甘草有效物质的深加工产品，向甘草有效成分提取的深加工发展。(4)生产工艺的开发，甘草中的有效物质的多样性，要求我们天然产物研究人员制定合理生产工艺，对甘草资源合理利用加上重点，改良旧的生产工艺，设计新的提取工艺，以降低生产成本，提高提取率，提高甘草中有效物质的纯度，增加产品的附加值。1.6

33、本课题研究的目的、意义和主要容1.6.1本课题研究的目的和意义近年来随着甘草黄酮类物质药理作用研究的深入，尤其是具有较强的抗爱滋病活性，使甘草黄酮提取工艺研究越发重要。国有些生产厂家所用工艺落后，也不同程度地造成资源的浪费。对甘草的深度开发和综合利用是一项值得重视的课题。甘草的植物化学成杂，其主要的有效成分是三萜类和黄酮类化合物，而以往人们只对甘草中化合物作了大量深入的研究，对其质量评价也仅以甘草酸的含量作为质量准，显然难以全面地评价甘草的质量。近年来，随着对甘草药理作用的深表明甘草黄酮类化合物具有多种药理作用43，是一类非常有效的活性成分目前中药甘草研究的热点。临床与药理研究表明，甘草黄酮类

34、成分中的甘和光甘草定具有抗氧化23,68-71、抗肿瘤72-75、抗菌44,76、免疫促进和雌激性27,77,78等多种活性，在食品、医药和化妆品工业中有广泛的用途。因此草中总黄酮与重要黄酮单体的的分离和药效研究，建立甘草总黄酮与重要的含量测定方法，制定其相应的质量标准，开发其潜在的药用价值，对有利用甘草资源具有十分重要的意义。由于人们对甘草无保护地洗劫性采挖，使野生甘草资源濒临枯竭，更重要的是使生态环境遭到破坏，导致草原沙化、气候恶化、水土流失严重。国家为保护种植甘草中的黄酮提取纯化工艺研究生态环境，立法并采取一系列措施，保护草原、山林与濒危物种，野生甘草被列入保护物种，禁挖、禁运。为解决甘

35、草供需矛盾，国家出台政策在对野生甘草禁止采挖的同时大力推广和研究甘草的种植技术，但是家种甘草产品能否替代野生甘草，黄酮含量是否达到药典标准，还是当今关注的热点。为实现甘草资源高附加值产品的加工生产奠定了产业化基础。应用该工艺，将对种植甘草的后续开发具有重要的研究价值。1.6.2本课题研究的主要容本题目主要是对影响甘草中黄酮成分提取率的各个因素进行研究，筛选黄酮提取生产的最佳工艺条件。甄选提取方法，提取溶剂，并对提取过程中的温度、时间、提取次数等各个因素与提取效果的影响进行全面的考察，采用响应面分析法筛选优化的提取黄酮的生产工艺条件与参数。2甘草中黄酮成分的提取研究甘草的植物化学成分十分复杂，其

36、药用有效成分为甘草酸和黄酮类化合物以与水溶性浸出物、还原糖、淀粉、氨基酸、有机酸、生物碱和多种金属元素等。近年来，随着人们对甘草药理作用的深入研究，结果表明甘草黄酮类物质是非常有效的活性成分，己成为研究的热点。而随着甘草资源的过度开发，甘草资源已受到前所未有的破坏。如何有效地利用有限的甘草资源成了巫待解决的问题。本章采用分光光度计测定了甘草中总黄酮的含量，为合理开发利用甘草资源提供依据。2.1材料和方法2.1.1实验材料与试剂甘草：市仲景大药房亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯，95%乙醇、甲醇、无水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯等2.1.2实验仪器与设备721GW可见光分光光度计 精密科学食

37、品离心机 中兴伟业仪器pH计 精密科学仪器酒精计 精密科学仪器电子天平 赛多利斯天平恒温振荡器 杜甫仪器厂芦丁 试剂厂2.2实验方法2.2.1工艺流程黄酮成分粗提时的大致工艺流程如下：甘草粉碎浸提抽滤合并滤液减压蒸馏真空干燥黄酮类化合物2.2.2黄酮类化合物的测定原理黄酮类特是广泛存在于植物中的一类黄色素，在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合物，在碱性环境下显红色，采用络合分光光度法，以芦丁为对照品测定甘草中总黄酮的量，加入铝离子试剂使黄酮类化合物与铝盐形成络合物在可见光获得稳定的吸收峰。因此采用NaNO2Al(NO3)3显色法，利用紫外可见分光光度计在较大稳定吸收波长5

38、07nm处测定吸光度值，对照芦丁标准曲线，测得总黄酮的含量，计算出黄酮提取率。2.2.3芦丁标准曲线的绘制准备称取经105烘干至恒重的芦丁标准品15mg，用80%乙醇溶解定容在100mL容量瓶，得到0.15mg/mL的芦丁标准液，精密吸取0.0mL, 1.0mL, 2.0mL, 3.0mL, 4.0mL, 5.0mL, 6.0mL的芦丁标准液于七个洁净的25mL容量瓶中，分别向这七个盛芦丁标准液的容量并中加入6.0mL, 5.0mL, 4.0mL, 3.0mL, 2.0mL, 1.0mL, 0.0mL的80%乙醇溶液，然后向每个容量瓶中各加入5%NaNO2溶液1.0mL充分振荡后静默6min，

39、再向每个容量瓶中加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL,充分振荡后静置6min，向每个容量瓶中加入10%NaOH溶液10.0mL,然后用80%乙醇定容至25mL容量瓶刻度处，充分振荡后静置15min,在507nm处测吸光度。242.2.4甘草中黄酮提取率计算提取率=提取物的重量（mg）/甘草的重量（g）2.2.5单因素试验(1)不同溶剂对提取率的影响分别准确称取2.0g甘草粉，在固液比1：25(g/mL),50的水浴，振荡速度140r/min条件下提取2h，分别的提取溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯。(2)不同温度对提取率的影响分别准确称取2.0g甘草粉，75%乙醇作为提取溶剂，固

40、液比1：25(g/mL), 振荡速度140r/min，在不同温度下提取2h，提取温度分别为：30、40、50、60、70、80、90。(3)不同时间对提取率的影响分别准确称取2.0g甘草粉，75%乙醇作为提取溶剂，固液比1：25(g/mL),提取温度50， 振荡速度140r/min条件下，提取时间分别为：0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h。(4)不同浓度对提取率的影响分别准确称取2.0g甘草粉，乙醇作为提取溶剂，固液比1：25(g/mL), 提取温度50， 振荡速度140r/min条件下提取2h，乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%、1

41、00%。(5)不同液固比对提取率的影响分别准确称取2.0g甘草粉，75%乙醇作为提取溶剂，提取温度50， 振荡速度140r/min条件下提取2h，液固比分别为：10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1。(6)不同提取次数对提取率的影响分别准确称取2.0g甘草粉，75%乙醇作为提取溶剂，固液比1：25(g/mL),提取温度50，荡速度140r/min条件下提取2h，提取次数分别为：1次、2次、3次。2.2.6响应面实验优化提取条件采用PlackettBurman设计、中心组合设计、响应面分析法。本研究的试验设计、数据分析与模型建立皆采用SAS软件(Version9.0

42、)来进行。根据前边单因素试验，确定提取溶剂为乙醇。以不同的提取温度、提取时间、提取溶剂浓度、液固比做响应面分析试验。因素水平如表：表21部分析因试验设计因子与编码值Table 21 Analyzes the factor of design and coding value水平液固比X1(mL:g)乙醇浓度X2(%)提取时间X3(h)提取温度X4()提取次数X5（次）-125:1601.5501030:1702602135:1802.57032.2.7验证试验根据响应面分析试验，确定提取温度、提取时间、提取溶剂浓度、液固比、提取次数进行验证试验。2.3结果与分析2.3.1芦丁标准曲线的绘制与结

43、果将浓度为0.15mg/mL的芦丁标准液在507nm处测吸光度值，如表22所示：表22芦丁标准液在507nm处的吸光度值Table 22 Rutin standard solution absorbance at 507nm Department芦丁标准液体积(mL)芦丁含量(mg)吸光度值0.00.000.0001.00.150.0652.00.300.1163.00.450.1564.00.600.2125.00.750.2656.00.900.310根据数据得到芦丁含量和吸光度值之间的一元线性回归议程为：y=0.3395x+0.0078其中y：507nm处的吸光度值；x：黄酮的含量(mg

44、)；经过计算，相关系数为：R2=0.9975，回归极显著。所以在浓度为00.9mg/mL的围，是可以用该方法检测芦丁含量的。图22芦丁标准曲线Fig. 22 Rutin criterion liquid2.3.2单因素试验结果(1)提取溶剂的选择图23不同提取溶剂对应的黄酮提取率Fig. 23 Corresponding to different solvent extraction yield由图23可以看出以甲醇和乙醇为提取溶剂所得到的提取率较高，且甲醇作为提取溶剂时提取率比乙醇稍高，但考虑到溶剂的成本价格与对环保问题的综合影响因素，决定选取乙醇作为以下试验的提取溶剂。(2)提取温度的选择温度()图24不同提取温度对应的黄酮提取率Fig. 24 Temperature corresponding to different extra