复合bFGF缓释微球的制备与性能测定

1、复合bFGF缓释微球的制备与性能测定 作者：刘锐，黄沙，金岩，吴红，姜玲，刘涛【关键词】 ,碱性成纤维细胞生长因子 Preparation and characteristic test of bFGFimpregnated microsphere【Abstract】 AIM: To prepare the basic fibroblast growth factor (bFGF)impregnated microsphere and to study its characteristics. METHODS: The bFGFimpregnated microsphere was prepa

2、red by improved emulsified coldcondensation method. The physical properties, drug content and encapsulation were detected. The drug release in vitro was measured by ELISA. RESULTS: The average diameter of microsphere was (12.43.6) m, the average drug content was 0.24% and encapsulation was 96.82%. I

3、n vitro, 28.23% of bFGF was sustainedreleased on the first day, 57.19% from the second to the fifth day and 93.94% by the seventh day. CONCLUSION: The preparation method is simple, rapid and accurate and the release of bFGF from the microspheres can be sustained for a longer time.【Keywords】 basic fi

4、broblast growth factor; microsphere; sustainedrelease; encapsulation【摘要】 目的：制备复合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的可降解缓释微球，考察其各项性能，为进一步应用于组织工程奠定基础. 方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF的缓释微球，测定微球形态、粒径、载药率和包裹率等，并采用ELISA法考察其体外bFGF的缓释效能. 结果：缓释微球平均粒径(12.43.6) m；平均载药率为0.24%，平均包裹率为96.82%. d 1体外释放28.23%，25 d时累积释放率达到57.19%, d 7时释放减慢且累计浓度

5、为93.94%. 结论：复合bFGF的缓释微球制备工艺简便，性能优良；可在较长时间内持续释放活性bFGF，与组织工程支架的结合应用具有可行性.【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子；微球；缓释；包裹率0引言生长因子的应用一直是组织工程领域的重要课题之一. 它具有多种生物学活性，可提供有利于细胞生长的微环境，促进新生组织血管生成等1. 但由于生长因子半衰期短，溶液进入体内后迅速扩散、变性或酶解，难以保持其生物活性2. 我们制备复合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的缓释微球载体，并考察微球形态、粒径、载药率、包裹率及释放效果等性能，以期利

6、用此种新型载体在较长时期内持续释放bFGF，为今后与组织工程支架的结合应用奠定基础.1材料和方法1.1材料明胶(等电点50，相对分子量99 000，华美生物工程公司)，人重组bFGF溶液(25 mg/L，等电点9.6，Sigma公司)，人bFGF定量EIA试剂盒（QuantiKineR, R&Dsystems），250 g/L戊二醛，丙酮，异丙醇，无水乙醚，液体石蜡，氨基乙酸为国产分析纯，Span80(Sigma公司)为进E1分析纯，水为双蒸水，JJ1型精确电子搅拌器仪，TGL16G高速离心机，GENESIS冻干机(Virtis公司)，BX41数码显微镜（Olympus).1.2方法1.2.1

7、复合生长因子微球的制备将含有10 g/L Span80的液体石蜡30 mL置于三口瓶中预热至55，快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4 mL，并调节搅拌速度至450 r/min，继续搅拌10 min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴，继续搅拌10 min，使其完成固化；加入250 g/L戊二醛0.1 mL，搅拌下预固化2 h，4固化24 h，用适量丙酮、异丙醇、乙醚洗涤，挥去乙醚，真空干燥，得淡黄色粉末状微球，将200 L的bFGF溶液滴加在20 mg的冻干明胶微球上，在室温下保持30 min以使bFGF完全融入微球. 钴60照射灭菌封存. 以丙酮为分散剂将空白微球样本及含有bFGF的微球样本置于

8、光镜下，观察其外形及分散度. 同时测量500个微球的直径计算其平均粒径. 以算术平均径为微球的平均粒径，计算公式为：平均粒径=n1d1+n2d2+nndn/n1+n2+n3+nn 式中n1,n2nn为粒子数，d1,d2dn为粒径.1.2.2微球含量及缓释性能测定根据人bFGF定量EIA试剂盒说明书配置标准液，在492 nm处测各孔A值. 以标准品0，8，16，31，62，125，250和500 ng/L之A值作出标准曲线并拟合线形回归方程. 取微球样品20 mg,放入PBS缓冲液中，加热至完全溶解，冷却后再用缓冲液稀释定容. 测出A492 nm值，然后在标准曲线上查处相应bFGF含量，并由此计

9、算出微球的载药率以及标准率. 载药率=（bFGF质量/缓释微球质量）100%. 包裹率=（bFGF质量/缓释微球中bFGF理论质量）100%. 取缓释微球(2 mg)，用PBS缓冲液100 mL作为溶出介质. 药物体外溶出仪的温度保持在(37.00.5)磁力搅拌转速100 rmin. 分别于各时间点(1，2，3，4，5，6，7 d)取样100 L. 每次取样后，立即补充同温度的PBS缓冲液100 L. 按17 d顺序，将稀释10倍的样品，分别加入微孔板7个孔中，每孔加样50 L并同时加入样品稀释液各50 L. 将反应板充分混匀后置37 120 min. 用洗涤液将反应板充分洗涤46次，向滤纸上

10、印干. 每孔加入第一抗体工作液50 L,将反应板置37 60 min. 洗板，并在每孔中加入酶标抗体工作液100 L.将反应板放置于37 60 min. 洗板后加入底物工作液100 L，置37暗处反应10 min. 每孔中加入一滴终止液，混匀. 在A492 nm处测各孔值. 根据A值在标准曲线上查出相应bFGF含量.百事通 2结果2.1缓释微球的形态和粒径空白缓释微球呈圆球状，形态及粒径大小较均匀（Fig 1A）；复合有bFGF的缓释微球经溶涨体积变大，形态饱满(Fig 1B). 微球粒径720 (12.43.6) m，占85.6%.2.2bFGF标准曲线在492 nm处测各孔A值，由此绘制标

11、准曲线（Fig 2）并拟合线性回归方程为： A=0.0042C+0.0154，r=0.9996 （P0.001），bFGF在0500 ng/L范围内符合线性关系.2.3缓释微球中bFGF的含量在492 nm处测定得A值，根据回归方程计算出相应bFGF含量. 缓释微球中bFGF质量为4.841 g，由此得出微球平均载药率为0.24%，平均包裹率为96.82%（n=5）.2.4缓释微球体外溶出度测定由缓释微球体外释放样品各个时间点的A值得出的bFGF浓度，并由此绘制出微球体外累积释放量曲线（Fig 3）.A: Blank; B: bFGFimpregnated.3讨论bFGF是一类具有较高活性的多

12、聚肽，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛的生物学活性，可改变一些细胞的趋化性，诱导或抑制特殊蛋白质的合成或分泌3. 但由于这种多功能细胞因子半衰期短，易失去活性,应用效果不甚理想. 我们设计的缓释微球可缓释药物、靶向输送、保证药物的治疗作用的前提下减少给药剂量以及降低药物毒性等4. 通过含量测定，缓释微球对bFGF的包裹率可达96.82%. 体外证实，复合bFGF缓释微球在7 d内对上皮细胞仍有促进增殖活性5. bFGF的累积释放量呈缓慢上升趋势， d 1累积释放率为28.23%，不存在初始阶段的“突释”现象6；25 d，累积释放量率57.19%,克服了部分同类产品释放药物时初期浓度过

13、大，短期内又迅速降低现象;到7 d时，累积释放率达到93.94%，虽然释放速率减慢，但体外仍有bFGF生物活性.本实验对缓释载体的研制尚处于实验室阶段，但由于此种缓释微球性能优良，可以根据组织工程化产品应用的不同需要，生产出包裹其他药物的缓释微球，也可同时包裹几种生长因子发挥联合调控的作用. 本设计工艺简便，能较长时间持续释放活性生长因子，在组织工程研究领域具有广阔的应用前景.【参考文献】1 Richardson TP，Peters MCPolymeric system for dual growth factor deliveryJNat Biotechnol, 2001;19(9)：102

14、9-1034.2 Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et al. Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factorimpregnated gelatin microspheres into artificial dermis J. Biomaterial，2000;21：489-499.3 Kinsella L，Chen HL，Smith JA，et alInteractions of putative heparinbinding domains o

15、f basic fibroblast growth factor and its receptor，FGFR1，with heparin using synthetic peptidesJGlycoconj J，1998；15：419-4224 Maysinger D， Krieglstein K， Filipovic J，et al Microencapsulated ciliary neurotrophic factor：Physical properties and biological activitiesJ Exp Neurol， 1996；138：177-l885 黄沙，金岩, 吴红. 制备复合生长因子的缓释微球并考察其对细胞的影响J. 上海生物医学工程,2004；25（4）：22-25.Huang S, Jin Y, Wu H. Prepar