银染增强的纳米金标记探针对微量核酸的检测

1、ISS N 100727626C N 1123870Q中国生物化学与分子生物学报2006年 11月 22(11 :919923 技术与方法银染增强的纳米金探针技术检测微量核酸赵立凡 , 李柏生 , 黑笑涵 , 李晓波 , 李媛媛 , 徐顺清3(华中科技大学同济医学院 公共卫生学院 环境医学研究所 环境与健康教育部重点实验室 , 武汉 430030摘要 利用银染增强的纳米金技术建立了一种简单快速的核酸定量方法 . 该方法基于纳米金与烷巯基修饰的寡核苷酸分子共价键合作用 , 将纳米微粒报告基团标记在与靶核酸一端序列互补的寡 核苷酸上 , 同时生物素化修饰另一端互补序列 . 靶核酸与两段寡核苷酸探针

2、杂交后 , 借亲和素固定 在酶标板孔内 , 通过纳米金催化的银染放大效应产生高灵敏的识别信号 , 适时记录其吸光度值从而 实现核酸分子的定量 . 该检测方法检测单链核酸分子的灵敏度达 011fm ol L , 双链分子为 10fm ol L. 关键词 纳米金 ; 核酸检测 ; 银染增强 中图分类号 R115A Colorimetric B ased onN E nhancement2, X iao 2Han , LI X iao 2Bo , LI Y uan 2Y uan ,X U Shun 2Qing3K ey Laboratory o f Environment and H ealth ,

3、 School o f Public H ealth , Tongji Medical College o fHuazhong University o f Science and Technology , Wuhan 430030, China Abstract A sim ple g old nanoparticle 2based method to detect micro am ount of polynucleotide m olecules withsilver staining enhancement is established. Based on the covalence

4、action of thiol 2m odified olig onucleotides with nanoparticles , the nanoparticles was utilized as biomarkers to detect trace am ount of polynucleotides. T w o kinds of probes , which were respectively com plementary to one half of target polynucleotides , were labeled respectively with biotins and

5、 nanoparticles. The hybridization products of target polynucleotides with these tw o kinds of probes were imm obilized to microplates via avidin 2biotin system , and the signals of g old nanoparticles were subsequently am plified by silver staining s olution , and recorded with colorimetric abs orba

6、nce. This sandwich colorimetric assay can detect as few as 011fm ol L for single 2strand target polynucleotides and 10fm ol L for double 2strand target polynucleotides. K ey w ords g old nanoparticles ; polynucleotides detection ; silver staining enhancement收稿日期 :2006204207, 接收日期 :2006207211国家自然科学基金

7、资助项目 (N o 1203770173联系人 T el :027283693417,E 2mail :xushunqingyahoo. com. cnReceived :April 07,2006;Accepted :July 11,2006Supported by National Natural Science F oundation of China (N o 1203770173C orresponding author T el :027283693417,E 2mail :xushunqing yahoo. com. cn 现知的人类疾病都与基因有着直接或间接的关 系 , 核酸的

8、检测和分析在遗传性疾病 、 传染病和肿瘤 等领域的应用日益广泛 . 以往的方法大多是建立在 标记有放射性核素 , 荧光或化学发光物质的探针与 靶核酸序列杂交的基础上 . 放射性标记检测体系需 要特殊培训的技术人员 , 且还会面临放射性污染及 标记活性受半衰期限制的问题 . 而荧光标记在其寡 核苷酸序列的制备及杂交检测方面对仪器设备的要 求均较高 , 且荧光标记物质也比较昂贵 , 这是一般实 验室条件无法达到的 . 另外 , 虽然近年来核酸的扩增 检测技术迅速发展并广泛应用于临床科研微生物学 检测等 , 但这些检测系统和方法往往存在扩增量低 , 自身的引物设计和荧光素标记探针繁琐 , 对设备要求

9、高及扩增污染等缺陷 1, 限制了该扩增检测技术 的应用 . 因此特异核酸的检测亟需建立一种快速 , 高 效 , 易于实施的检测新方法 .近年来随着纳米技术的发展 , 一些基于寡核苷 酸修饰纳米金标记及其颗粒大小依赖的光散射 , 催 化作用及吸光特性等的核酸定量方法得以进一步研 究 28. Mirkin 等利用纳米金在以 DNA 片段为组装 分子的引导下形成超分子结构的特点 , 建立了用纳 米金标记寡核苷酸探针并检测特定多核苷酸序列的 新方法 , 为特定 DNA 序列检测的研究和应用开辟了 一个新领域 . Mirkin 等通过纳米金标记两套不同的 单链核酸探针同时与目的序列搭桥结合建立了一种 核

10、酸分析的方法 , 杂交后可形成聚合网络结构 , 溶液 颜色随之发生改变 , 通过银染或滴加少量溶液至 C 18薄层 层 析 板 上 来 观 察 信 号 的 改 变 9. 已 报 道 的Mirkin 等建立的方法检测限是 50fm ol L 6. 而我们 发现目的核酸的浓度与银染增强的纳米金标记探针 信号间存在良好的线性关系 , 在此基础上建立了更 为简单灵敏的核酸定量的有效方法 , 检测单链核酸 分子的灵敏度达 011fm ol L , 双链分子为 10 fm ol L.1 材料与方法111 检测微量核酸技术原理本研究目的在于建立一种灵敏度高 , 选择性强 的核酸比色定量方法 , 该方法通过优

11、化杂交条件利用亲和素 2生物素系统实现核酸的检测 (Fig 11 . 目的 核酸先与生物素标记的互补探针及纳米金标记的互 补探针杂交 , 然后将杂交产物转至亲和素包被好的 酶标板内 . 杂交缓冲液为 013m ol L NaCl , 0105%S DS ,10mm ol L 磷酸盐缓冲液 , 杂交产物即可由亲和素 2生物素作用锚定于固相载体酶标板上 , 经 1×P BS 和 2×P BN 溶液洗涤 5次后 , 再加银染增强液 , 杂交信号随之放大 , . 112 Fig. 1 The scheme of colorimetric method b ased on nanop

12、 articles with silver staining enh ancement(A Hybridization of the target polynucleotides with biotin 2labeled probes and g old nanoparticles 2functioned probes ; (B Imm obilization of the hybridization products to microplates via avidin 2biotin system ;(C Am plification of g old nanoparticle signal

13、s by silver enhancement s olution with the record of colorimetric abs orbance 烷 巯 基 标 记 的 核 酸 序 列 购 于 Invitrag onBiotechnical 公司 ,S eq1:5 2Bio 2gcagtT CC AGG CT CTT CT C A 23 (capturing probe Seq2:5 2TG CCCCGG AG TTG CG TG AG AAG AG CCT GG A 23 (target sequence Seq3:5 2CG C AACTCCGGGG C A 2(CH 2 62S

14、H 23 (nanoparticle probe Seq4:5 2TCC AGG CTCTTCTC ACG C AACTCCGGG G C A 23 (control sequence Seq1和 Seq3溶解于 TE 缓冲液 (10mm ol L Tris 2HCl , 1mm ol L E DT A , pH 714 . 中 ,Seq2和 Seq4直接溶解于超纯水中 .直 径 15nm 的 纳 米 金 购 于 Sino 2American Biotechnology 公司 .酶标板 (C orning Star 购于 G enetimes T echonolgy 公司 .AgNO 3, 柠

15、檬酸 、 柠檬酸三钠及氢醌购于生物工 程 (上海 有限公司 . 113 纳米金标记核酸探针的制备按照 Mirkin 2,Zhang 10等所述方法标记纳米金 探针 , 具体如下 :29中国生物化学与分子生物学报 22卷a 胶体金溶液 500l ,4 14000r min 离心 20 min , 弃上清 ;b 加巯基标记序列 (Seq3 100m ol L ,3l , 和 47l TE 缓冲液 , 混匀成 50l 体系 14 ,12h ; c 加等体积 (50l 012m ol L NaCl ,20mm ol L P B (20mm ol L Na 2HPO 4NaH 2PO 4,pH 710

16、, 使其终 浓度为 011m ol L NaCl , 10mm ol L P B , 迅速混匀 , 4 ,24h ;d 取上清 ,4 ,14000r min 离心 10min , 弃上 清 , 加 100l 超纯水重悬后再次离心 , 弃上清 , 以去 除多余的未标记上的单链核酸 ;e 加 100l 011m ol L NaCl ,10mm ol L P B (pH 710 混匀 , 置 4 储存备用 .114 酶标板包被亲和素a 亲和素 (1mg ml 用碳酸盐包被液按 1 100稀释 , 每孔包被 100l , 潮湿环境下 4 过夜 ; (盐包被液 Na2C O 3, 0116g , 3g

17、, ml H 2O ,pH 916;b 1×P 4, 1 (V V T ween20 , 洗 涤 2次 , 拍干 .115 杂交a 杂交缓冲液 (013m ol L NaCl , 0101%S DS , 10 mm ol L P B (pH 718 20l , 生物素标记探针 (Seq1 10 nm ol L ,10l , 不同浓度目的核酸 (Seq2 各 10l , 混 匀 ,25 ,10min ;b 加胶体金标记探针 (Seq3 5l , 混匀 ,25 , 10min ;c 将该 45l 体系杂交产物转移到各酶标板 孔 ,37 保温 20min , 倾倒干净 ;d 1×

18、P BS 洗涤 1次 , 拍干 ,2×P BN (013m ol L NaNO 3and 10mm ol L Na 2HPO 4NaH 2PO 4,pH 710 洗 涤 2次 , 拍干 .116 银增强 (避光 取银增强液 015g AgNO32ml H 2O , 12l ; 117g 氢醌 30ml H 2O ,300l ;2155g 柠檬酸 2135g 柠檬酸三钠 10ml H 2O , 100l.后两种溶液需新鲜配制 , 确保无结晶析出且无 色 , 氢醌和柠檬酸 (300l 100l 混和液应在银染前 30min 左右保持 37温育 , 银染用时再 加 12l AgNO 3迅速

19、混匀立即分加入各酶标板孔内 , 每孔 100l , 放在温箱里反应 . 反应一定时间后 , 置入超纯水 中 , 终止反应 .银染增强反应最好在避光或弱光下反应 , 以减 少银自身成核反应 , 增强特异性 1113.117 酶标仪检测 630nm 处吸光度值2 结果211 单链核酸分子定量该方法检测单链核酸分子简单快速 , 加入银增 强剂可显著放大胶体金标记信号 , 从而可检测到极 低含量的胶体金 . 本方法对单链核酸分子的检测限 可达 100am ol L (Fig 12 .2ange of the single 2strand target The silver enhance time i

20、s 150s在银增强时 , 我们观察到随着时间的推移 , 银增 强液的灰度会不断增加 , 尤其是通过杂交锚定于酶 标板上的纳米金颗粒可显著加速银颗粒的聚集 , 即 纳米金银染增强信号的吸光度值变化是剂量时间依 赖性的 (Fig 13 . 在一定的时间控制下 , 银增强的灰 度值变化与不同浓度目的核酸序列 (Seq2 杂交系中 固定于酶标孔内的纳米金颗粒的量呈正相关 . 通过 一系列实验优化 , 选择出最合适的时间段 100 150s 终止银染 , 得出银增强吸光度值与不同浓度目 的核酸分子的良好线性关系 (Fig 14 .212 双链核酸的定量本研究的核酸比色定量方法依赖于单链核酸的 选择性互

21、补杂交 , 因此 , 为了对双链核酸分子进行定 量 , 先要在加入探针前进行变性 , 探针与变性的原单 链互补核酸分子竞争结合到目的单链核酸分子上 , 加入过量的纳米金标记探针和生物素标记序列以使 探针杂交竞争超过原互补序列 , 而且通过选择性结 合和洗涤 , 可以很大程度上去除未结合的探针 , 从而 显著降低背景值 .实验中 , 双链核酸分子 (Seq2 Seq4 (10l , 不同 浓度 先 95 变性 3min , 然后将 EP 管迅速加入干 冰 异丙醇冰浴 3min , 再加入 10l 生物素标记的探 针液 (Seq1, 100nm ol L , 10l 纳 米 金 标 记 探 针 (

22、Seq3 , 及 20l 2×杂交缓冲液 , 室温下温育 20 min , 后续程序同单链检测 . 目前双链检测核酸最低 129第 11期 赵立凡等 :银染增强的纳米金探针技术检测微量核酸 Fig. 3 The time 2absorb ance (A relationship of various concentrations of target oligonucleotide with silver staining enh ancement( BFig. 4 Correlation betw een the absorb ance values of silver enh an

23、cement and concentrations of target single 2strand sequenceThe controlled silver enhance time was 150s and the concentrations of target sequence varied from 1pm ol L to 100am ol L. Values represent x ±s of independent triplicate determinations.检测限为 10fm ol L (Fig 15,6 .Fig. 5 The time 2absorb a

24、nce relationship of various concentrations of double 2strand polynucleotides with silver staining enh ancement实验结果显示 , 观测到的信号增强是由目的核 酸特异性杂交的结果 . 在无 Seq2情况下 , 胶体金标 记的探针并不会与生物素标记序列非特异性结合 , 在加 Seq4而不含 Seq2的阴性对照组中 , 亦无明显Fig. 6 Correlation betw een the absorb ance values of silver enh ancementandconcentr

25、ationsofdouble 2 strandpolynucleotides (Seq2 Seq4The controlled silver enhance time was 150s and the concentrations of target polynucleotides varied from 100pm ol L to 10fm ol L. Values represent x ±s of independent triplicate determinations.信号增强 .3 讨论基于寡核苷酸探针共价连接的可在不同条件下显示色度信号变化的纳米金技术 ,Mirkin

26、等将纳米 金标记的核酸探针与互补目的序列杂交成多聚网络 结构 , 胶体金溶液颜色随之由红色变蓝 14,15, 从而检 测目的核酸的量 . 该体系的颜色变化给出的杂交信 号依赖于聚合凝聚体中纳米金之间的距离 , 因而纳米金聚合网络形成时的沉降会影响终点的观察 16. 本研究利用生物素标记寡核苷酸序列作为固相末 端 , 将纳米金标记探针与互补的目的核酸共杂交产 物锚定于固相载体上 , 可有效避免纳米金溶液体系 中聚合网络沉降对观察终点的干扰 , 与银染法结合 更提高了检测的灵敏度 .银增强纳米金检测痕量核酸的方法将目的核酸229中国生物化学与分子生物学报 22 卷与纳米金标记探针及生物素标记探针充

27、分杂交后再 将该特异性杂交产物捕获到固相载体酶标孔内 , 使 得杂交条件得以充分优化从而提高了检测灵敏度 . 而已有的相关文献报道中探针多固化在聚丙烯薄片 上再进行杂交 , 如此会影响杂交效率 , 降低检测灵 敏度 .纳米金标记银增强方法不仅发挥了纳米金标记 的优势 , 更利用了银染增强技术将信号有效放大 . 但 值得注意的是 , 银染中银原子的自身聚合所引起的 一定背景值会干扰纳米金催化的银增强效应的观 察 , 只有在信号扩增曲线的指数期相才可以获得吸 光度值与目的核酸浓度之间良好的梯度关系 . 若银 染时间过长 (超过 5min , 则银染强度均到达平台 期 , 不能区分梯度关系 . 因此

28、 , 银增强时间控制在时 间 2吸光度值曲线指数相内 , 多次实验优化后一般选 择 100150s.,.子两端互补结合 , 生成 5 端标记生物素和 3 端标记 纳米金的双链核酸分子 . 当杂交产物转移入包被有 亲和素的酶标孔内 , 经温育后 , 标有生物素的双链核 酸即被捕获 , 未结合的过量探针被洗涤去除 . 通过银 染增强 , 结合在酶标孔上的纳米金标记信号即可放 大 105倍 , 从而使得纳米金标记肉眼都可粗略观察 到 . 通过检测其银染吸光度值可以绘制标准曲线进 行定量检测 .该纳米金标记银增强检测方法检测单链核酸的 灵敏度为 011fm ol L , 双链为 10fm ol L ,

29、 方法快速简 便 、 灵敏度高 , 约 60min 即可完成一次检测 , 且不需 要特殊仪器或 PCR 扩增 , 可直接检测样本中微量的 病原体 DNA , 其显著优势在于甚至用肉眼观察即可 获得半定量结果 , 因而适用于大量生物样本的初筛 , 对感染性病原体或遗传性疾病进行快速检测及鉴 定 , 可望在基层广泛推广 .参考文献 (R eferences 1 G iulietti A , Overbergh L , Valckx D , et al . An overview of real 2time quantitative PCR :applications to quantify cyt

30、okine gene expression J.M ethods , 2001, 25(4 :38624012 M irkin C A , Letsinger R L , Mucic R C , et al . A DNA 2based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materialsJ. Nature , 1996, 382(6592 :6072609 3 E lghanian R , S torhoff J J , Mucic R C , et al . Selective colorimet

31、ric detection of polynucleotides based on the distance 2dependent optical properties of g old nanoparticlesJ.Science , 1997, 277(5329 :10782 10814 Reynolds R A , M irkin C A , Letsinger R L. A g old nanoparticle latex microsphere 2based colorimetric olig onucleotide detection method J.Pure Appl Chem

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34、ferentiation of P olynucleotides with S ingle Base Im perfections Using G old Nanoparticle ProbesJ.J Am Chem S oc , 1998, 120:19592196410 Zhang Z L , Pang D W , Y uan H , et al . E lectrochemical DNA sensing based on g old nanoparticle am plification J.Anal Bioanal Chem , 2005, 381(4 :833283811 Lah J J , Hayes D M ,Burry R W. A neutral pH silver development method for the visualization of 12nanometer g old particles in pre 2 embedding electron microscopic immunocytochemistry J .J H istochem Cytochem , 1990, 3