NO功能及作用机制

1、NO功能及作用机制     引 言一氧化氮(nitric oxide，NO) 是第一个被发现的参与体内信号转导的气体信号分子，在神经系统、免疫系统、心血管系统等都发挥着重要作用。相比于 NO 功能的多样性，其作用机制也是复杂且相互关联的。NO 的作用可能是多靶点、多机制同时作用的网络调控。NO及其相关的氮氧化物衍生物可以修饰各种生物大分子，包括蛋白质、脂类和核酸等。这些修饰为 NO 提供了丰富的特异调控细胞信号转导的方式。其中，比较重要的可逆修饰包括对蛋白质半胱氨酸巯基的修饰蛋白质巯基亚硝基化，本文主要对蛋白质巯基亚硝基化进行介绍。NO作用的分子机制经典

2、的 cGMP 依赖的信号通路NO 可以结合可溶性鸟苷酸环化酶中血红素的亚铁离子，促进鸟苷酸环化酶将 GTP 转化为cGMP， 激活 cGMP 依赖的蛋白激酶 G (protein kinase G，PKG)，这介导了内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 产生 NO 的生物活性，并行使了 NO在细胞内的大部分功能。cGMP 刺激平滑肌细胞舒张有两种机制：降低胞内钙的浓度Ca2+i和降低收缩系统对钙的敏感度。前者是由于激活的 PKG 可以磷酸化几种关键的目标蛋白质，而这些蛋白质最终的作用是导致Ca2+i降低。特别是 PKG 可以激活钙激

3、活钾离子通道(KCa2+)，抑制膜上钙通道的活性，激活质膜和肌质网上钙 -ATPase 泵的活力，抑制 IP3及其受体的产生。cGMP 诱导的钙去敏化主要是通过抑制 RhoA 依赖的通路和激活肌球蛋白轻链磷酸酶的活力来实现的。金属中心反应除了血红素的亚铁离子，NO也可以结合很多酶的非血红素铁，比如 NADH- 泛醌氧化还原酶、NADH- 琥珀酸氧化还原酶、顺乌头酸酶和所有铁硫酶类。NO 可以结合铁储存蛋白 - 转铁蛋白，释放铁并导致脂质过氧化。NO 也可以结合核糖核苷酸还原酶的非血红素铁来抑制 DNA 合成。NO 结合铁的能力还可以影响铁代谢。铁代谢是通过蛋白质 -mRNA 相互作用来进行转录

4、后调控的，而巨噬细胞合成的NO可以刺激人干扰素调节因子(humaninterferon regulatory factor，IRF)，导致含 IRF 的 mRNA 的翻译抑制。在小脑脑片中，NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR) 激活所产生的 NO 可以通过对铁硫中心的替换增加IRF 的 RNA 结合活性。酪氨酸硝基化NO与 O2反应生成过氧亚硝酸根离子(peroxynitrite，ONOO)，ONOO与蛋白质酪氨酸反应产生 3- 硝基酪氨酸 (3-nitro-tyrosine，3-NT)。这种酪氨酸修饰称为酪氨酸硝基化1。3-NT 与很多疾病相

5、关，包括神经疾病 (Alzheimer 病、Parkinson 病、多发性硬化症和中风)及心血管疾病(动脉粥样硬化、心肌肥大、冠状动脉疾病、高血压和糖尿病性血管病变)，这些病因都与炎症相关。蛋白质酪氨酸硝基化也是 NO 病理作用的主要机制之一。不饱和脂肪酸的修饰NO 及其衍生物不仅能介导 DNA 的氧化损伤和蛋白质的修饰，还能修饰不饱和脂肪酸而生成硝基脂(nitrolipid)2。在人的血液和尿液中可检测到多种硝化的不饱和脂肪酸，它们可作为配体激活内源过氧化物酶增殖体激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)，从而介导相关信号转导

6、和生理功能调控。硝化的亚油酸还能通过活化内皮细胞heme oxygenase 1 (HO-1)来介导 NO 的信号转导作用。硝化的亚油酸 (L-NO2)和油酸(OA-NO2)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应具有抑制作用，是一种内源抗炎因子3。NO 对不饱和脂肪酸修饰的功能和作用机制还有待深入研究。蛋白质巯基的亚硝基化修饰蛋白质巯基亚硝基化修饰是NO 发挥广泛生物活性的主要分子机制之一。简单地说，蛋白质巯基亚硝基化修饰是活性氮对蛋白质半胱氨酸巯基的一种蛋白质翻译后修饰，通过该修饰形成的亚硝基巯基(S-nitrosothiols，RSNOs 或 Cys

7、-NO) 可调控蛋白质的结构、稳定性、细胞定位、蛋白质 - 蛋白质相互作用等，从而得以广泛发挥 NO 的生物活性。与蛋白质磷酸化修饰不同，该修饰依赖氧与半胱氨酸，是一种氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰。种主要存在形式。一氧化氮作用的分子机制简单总结如表1。蛋白质巯基亚硝基化的反应特点蛋白质巯基亚硝基化包括 NO 对蛋白质半胱氨酸巯基的直接亚硝基化，以及由低分子量巯基亚硝基化合物的转亚硝基化。直接亚硝基化可能的反应为：其中，-SNO 是亚硝基化的半胱氨酸，-SH 是自由的半胱氨酸，-NO 在两个分子间自由转 移。现 有 研 究 表 明 ， 通 过 GAPDH ( glyceraldehyde-3-

8、phosphate dehydrogenase) 和thioredoxin，可以促进 -SNO 在蛋白质间的转亚硝基化反应。而低分子量亚硝基化合物 (如S-nitrosocysteine)的转亚硝基化反应则是首先生成一种中间产物，再经一步反应完成转亚硝基化。低分子量巯基亚硝基化合物的体外合成反应为：蛋白质巯基亚硝基化产物一般不稳定，对光(特别是 340 nm 的紫外线) 及巯基还原试剂比较敏感，对部分金属离子(Cu+和 Fe2+)极其敏感。蛋白质亚硝基化修饰是一种可逆的特异性修饰，包括亚硝基化和去亚硝基化。最早的特异性研究结果表明，蛋白质巯基亚硝基化的作用位点多发生在蛋白质的疏水区半胱氨酸上，

9、能够被亚硝基化作用的一般只有一个或几个关键的巯基，分单亚硝基化修饰和多亚硝基化修饰。而后续研究表明，空间构象对亚硝基化修饰的特异性起关键作用，Ca2+、Mg2+、H+及 O2等可通过调控蛋白质构象促进亚硝基化修饰。与一氧化氮合酶 (nitric oxidesynthase，NOS) 共定位的蛋白质容易被亚硝基化。虽然许多酶参与调控蛋白质巯基亚硝基化反应，如超氧化物歧化酶、一氧化氮供体 GSNO (S-nitrosoglutathione) 还原酶和硫氧还蛋白还原酶可分别促进亚硝基化、转亚硝基化和去亚硝基化，但目前还未发现特异、典型的酶催化蛋白质巯基亚硝基化反应。亚硝基化蛋白质位点鉴定结果表明，

10、调节蛋白质功能的修饰仅仅来自于一个或者很少的Cys 巯基修饰，说明蛋白质的巯基亚硝基化修饰是有特异性的。研究结果表明，与特异性相关的因素包括蛋白质巯基pKa、疏水结构域、调节巯基溶液可接触性或反应性的调节物(Ca2+、Mg2+和O2/redox)，以及是否与NOSs 有相互作用。蛋白质巯基亚硝基化靶点和功能研究通过外源 NO 供体和内源产生的 NO 引起的亚硝基化，可以在体外 / 体内调节多种代谢酶、氧化还原酶、蛋白酶、蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性，以及受体 / 离子通道和转运体、细胞骨架、转录因子和调节因子 (包括 G 蛋白) 的功能。越来越多的证据表明，SNOs (包括大分子的蛋白质 -SN

11、O 和小分子的 -SNO，如 GSNO 和 Cys-NO 等) 可以作为 NO 供体起作用或者直接行使NO的功能，因为调控机体 SNOs 的水平也可以达到调控 NO 生理功能的目的。一些蛋白 (包括硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶等) 能调控SNOs水平。活性位点含有巯基的酶半胱氨酸蛋白酶Cys残基存在于很多酶的活性位点中并参与催化。在最早有关蛋白质亚硝基化的描述中，组织蛋白酶B (cathepsin B)的酶活被 NO 介导的巯基修饰抑制。后续研究表明，大部分半胱天冬酶(caspases)活性位点的Cys 可以被亚硝基化，使其酶活受到抑制4。磷酸酶与半胱氨酸蛋白酶一样，蛋白质酪

12、氨酸磷酸酶超家族 protein tyrosine phosphatase(PTPase) superfamily有一个保守的、位于活性中心的 Cys 残基。大量研究已证明，内源产生的活性氧可以抑制 PTPases，同时，NO+供体也可以可逆地抑制 PTPases 纯蛋白的酶活。完整细胞在暴露于外源 NO/SNO 或者 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 诱导后，活性被抑制的酪氨酸磷酸酶可造成磷酸酪氨酰蛋白(PTPases的底物)的水平增加5。精氨酸代谢相关酶类二甲基精氨酸二甲基胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohy

13、drolases，DDAHs) 能水解精氨酸衍生的内源 NOS 抑制物。其活性位点 Cys249 的亚硝基化可抑制此酶的活性6。最近，研究人员还发现，亚硝基化可抑制腺苷甲硫氨酸脱羧酶( S-adenosylmethioninedecarboxylase)7和甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosylytransferase)8的活性。这些结果提示，精氨酸(NOSs产生 NO 的底物) 的代谢 包括多胺 (polyamine) 的合成可能被一些功能相关酶的亚硝基化调节。N - 乙酰马来酰亚胺 - 敏感因子 -ATPaseN-乙酰马来酰亚胺 - 敏感因子 N-ethylmaleim

14、ide (NEM)-sensitive factor，NSF的同型六聚体在小泡膜运输过程中起关键作用。在完整内皮细胞中，NSF 都可以被外源或内源NO 亚硝基化9。亚硝基化对 NSF 本底的 ATPase 活性没有作用，但是会抑制 NSF 引起的膜融合复合体解聚，从而抑制膜融合。引入无亚硝基化的 NSF 可以恢复 NO 处理所抑制的细胞外吐，这有力地证明了NSF 的亚硝基化是 NO 抑制膜融合的主要机理之一。单体GTPases最初，人们发现小G 蛋白 p21RasCys118 位点被亚硝基化并激活，且这种激活不依赖于cGMP；而且，在缺失 nNOS (neuronal nitric oxide

15、 synthase) 的突变小鼠 (nNOS/)中激活NMDA受体也不会激活 p21Ras，说明 NO 对 ATP- 敏感的钾通道的激活是通过 Ras 的亚硝基化所介导的。最近，有报道称调节核质转运的 G 蛋白 Ran 在本底情况下被亚硝基化；G 蛋白 Dexras 被 NO 所激活，而存在于 nNOS/小鼠脑部的 Dexras 本底活性降低。这些证据都说明这类蛋白质的功能与亚硝基化修饰密切相关10。膜受体 / 离子通道已有研究表明，很多受体耦联的、阳离子激活的及电压调节的离子通道活性可以被内源亚硝基化调节。NMDA受体神经元NMDAR 介导突触后 Ca2+的流动，调节nNOS 活性，而 NM

16、DAR 反过来也是亚硝基化的底物；Cys399 的亚硝基化可以变构性调节配体结合及其与连接区域的相互作用，从而抑制 NMDAR 的功能11。Ryanodine受体骨骼肌的1 型 ryanodine 受体 /Ca2+离子载体(type 1 ryanodine receptor/Ca2+ionophoreof skeletal muscle，RyR1) 是控制从肌质网 (sarcoplasmic reticulum，SR) 释放 Ca2+的主要离子通道，并由此控制肌肉收缩。在纯化的 SR 囊泡中，RyR1 被亚硝基化所激活。内源nNOS产生的 NO 仅仅亚硝基化 RyR1 同型四聚体约 50 个自

17、由巯基中的一个，即位于 RyR1中、与钙调蛋白 (calmodulin，CaM) 结合的疏水结构域中的 Cys363512。心肌中的RyR2 在本底情况下被亚硝基化。亚硝基化激活 RyR2，抑制 Ca2+-ATPase 介导的肌质网Ca2+回收。在 nNOS/小鼠中，对-肾上腺素刺激的收缩反应的抑制结果表明，肌肉中的 nNOS 活性可以增强肌肉收缩能力13。转录因子缺氧诱导因子 HIF1在完整细胞中，GSNO 处理或者 iNOS 的诱导，可以导致 HIF1 的亚硝基化和转录活性的升高。Cys800是其亚硝基化的位点，亚硝基化控制了 HIF1 和 p300 的蛋白质 - 蛋白质相互作用及其转录活

18、性，是与以往 HIF 调控的机制不同的新机制14。核因子BNF-B家族的原型是在很多哺乳动物细胞中固有表达的 p50p65 异二聚体。NF-B 可以被外源 NO 或者 iNOS 诱导产生的 NO 亚硝基化，这抑制了 NF-B 依赖的 DNA 结合与启动子转录活性15。最近的研究发现，内源 IKK 的 Cys179 亚硝基化抑制了 IB 的磷酸化16。亚硝基化修饰在蛋白质核质转运中的作用研究发现，NO 供体 GSNO 通过蛋白质巯基亚硝基化修饰，可以诱导 DNA 碱基切除修复蛋白 APE1 (DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase) 的核输出，而过氧化

19、氢不能诱导APE1 出核，说明该现象是 NO 亚硝基化修饰特异的17。此外，NO 也能同时破坏 importin介导的核输入系统，进一步促使APE1 从核内全部清空。文献调研发现 NO 能调控一系列蛋白质的核内积累，如 Nrf2 (Nuclear factor erythroid2-related factor 2)和 p53 等，那么，NO 是否可以直接作用于核输出系统，从而调节相关蛋白质从核向胞浆的转位？进一步研究发现，经典核输出受体CRM1能被亚硝基化修饰，抑制其与核输出信号 NES 相互作用，从而抑制 CRM1 依赖蛋白质的核输出18。蛋白质巯基亚硝基化是调控蛋白核质转运的新分子机制。

20、亚硝基化修饰在调控其它蛋白质翻译后修饰的作用SUMO 化修饰NO可以通过蛋白质巯基亚硝基化修饰增强 Pias3 (Protein inhibitor of activated STATprotein 3)的泛素 E3 连接酶 Trim32 (Tripartite motif-containing protein 32) 与 PIAS3 的相互作用，从而降低SUMO (small ubiquitin-like modifier)修饰 E3 连接酶 PIAS3 的稳定性，下调细胞中的整体 SUMO 化水平19。该工作提示：调控其它蛋白质翻译后修饰，可能是氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰发挥作用的重要

21、途径。NO 生物活性受 NOS-GSNOR 双调控GSNOR下调可导致细胞内蛋白质亚硝基化水平显著增高，在细胞死亡中起关键作用20。利用果蝇模型的研究表明：与调控 NOS 一样，在果蝇脑中高表达 GSNOR 将导致果蝇学习记忆功能的缺陷21。结合相似研究结果，学者提出了 NO 生物学功能受 NOS-GSNOR合成和代谢双调控的观点22。根据该观点， GSNOR 可能成为调控 NO 生物学功能的新靶点，这对研究Alzheimer病等学习记忆和神经损伤相关的神经退行性疾病的发病机制具有潜在的参考价值。蛋白质巯基亚硝基化修饰与疾病的发生统计结果显示，蛋白质巯基亚硝基化产物在多种疾病中表现出异常升高或

22、降低。关节炎、糖尿病、多种硬化症、惊厥、败血症、肺结核、血胆脂醇过多、中风等疾病中的蛋白质巯基亚硝基化产物较正常水平明显增多；而在哮喘、新生儿血氧不足、肺气肿等疾病中，蛋白质巯基亚硝基化产物较正常水平明显降低。因此，调节蛋白质巯基亚硝基化修饰可能成为健康防护的一种新的有效途径23。蛋白质巯基亚硝基化修饰与肿瘤顺铂是治疗实体瘤的常用药物，有很强的细胞毒性作用24。但肿瘤细胞可以产生对顺铂的抗性，特别是在人肺癌中，这是顺铂治疗肿瘤的一个主要限制因素。2006 年，有学者报道了这种对顺铂抗性的新机制，认为是 NO 介导 Bcl-2 蛋白质巯基亚硝基化，抑制 Bcl-2泛素化降解，降低了细胞凋亡，从而

23、增加人肺癌细胞 H-460 对顺铂诱导的细胞凋亡产生抗性。另一个例证是血清骨桥蛋白(osteopontin，OPN)。OPN是与细胞黏附和迁移及肿瘤生长和转移密切相关的重要分子，其蛋白质表达调控机制是肿瘤研究中的重要问题。内毒素刺激鼠巨噬细胞产生大量NO，OPN 的转录和启动子活性被显著上调。这是由于 OPN 基因的转录被一个组成型的转录抑制蛋白所调控，即 hnRNP A/B (heterogeneous nuclearribonucleoprotein A/B)。大量产生的 NO 能够使 hnRNP A/B 发生亚硝基化修饰，抑制其DNA结合能力，从而抑制其转录抑制活性，导致 OPN 的表达

24、升高。可见，蛋白质巯基亚硝基化调控有可能成为肿瘤治疗的一个新途径。蛋白质巯基亚硝基化修饰与心脑血管系统疾病最近研究表明，血红细胞通过血红蛋白(Hb)的亚硝基化实现 NO/SNO-Hb 平衡的精确调节，行使血管舒张调节功能。NO/SNO-Hb 失衡或者 NO 运输的异常都可能导致红细胞的功能失常，造成血栓形成、缺氧等。目前发现的与红细胞 NO/SNO-Hb 失衡及 NO 运输异常相关的疾病有心力衰竭(heart failure)、镰刀贫血病(sickle cell anaemia)、败血症(sepsis)和先兆子痫(preeclampsia)25。研究发现，NO 在人扩张型心肌病中升高，NO 在

25、体外和细胞内都可以通过蛋白质巯基亚硝基化修饰使病毒蛋白酶 2A 失活，对心脏起保护作用，这与 NO 抑制小鼠柯萨奇 B3 病毒( Coxsackievirus B3，CVB3)心肌炎的作用相一致。镰刀贫血病的血红细胞膜上缺乏SNO，这影响了它们对缺氧血管舒张的调节能力。这种缺陷的程度和临床上疾病的严重程度正相关。NO 供体可以治疗镰刀贫血病，降低血管阻塞几率。羟基脲 (hydroxyurea) 治疗就是一个例子，它可以产生NO。而在败血症中，红细胞内的 SNO 作为败血症的疾病标志物之一，可能成为一个新的治疗靶点。先兆子痫血浆中的 SNO-Hb 和总 SNO 含量显著升高，这提示 NO 的释放

26、可能不足，说明维持血管正常调节需要的 NO 不足可能是导致这种疾病的发病机制之一。蛋白质巯基亚硝基化修饰与神经退行性疾病研究发现，在 Parkinson 模型小鼠和 Parkinson 病人的脑中均检测到 E3 泛素化连接酶Parkin被亚硝基化。该酶参与细胞的泛素化，控制许多特异底物的降解，帮助清除错误折叠蛋白质和非正常功能蛋白质，对多巴胺神经元存活具有重要作用。Parkin (E3ubiquitin-protein ligase parkin)被亚硝基化修饰后，连接酶活性被抑制，导致 parkin 底物泛素化异常，细胞内蛋白质降解过程不能正常进行，神经元死亡。2006 年又有研究发现，在A

27、lzheimer病和 Parkinson 病等与蛋白质聚集有关的神经退行性疾病病人的脑中，二硫键异构酶(protein-disulphide isomerase，PDI) 被亚硝基化。亚硝基化修饰后的 PDI，其分子伴侣活性和二硫键异构酶活性均降低，导致蛋白质不能正确折叠，从而不能形成发挥正常功能所需的三维结构。此外，在细胞信号转导中，蛋白质的结构变化需要该酶的催化，这些过程也会受到影响。在谷氨酸兴奋性毒性实验中，PDI 能降低内质网应激导致的蛋白质沉积，从而对细胞有保护作用；但 NO 作用后，PDI 被亚硝基化，活性被抑制，不能有效降低蛋白质沉积，失去对细胞的保护作用。PDI 亚硝基化使蛋白

28、质的错误折叠增加，非功能蛋白质沉积导致神经细胞功能异常。同样，基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase 9，MMP-9)在脑缺血过程中也可与NOS 共定位，发生亚硝基化并被激活，从而导致细胞外蛋白质水解，引起细胞凋亡，产生病理活性。以上结果说明，蛋白质巯基亚硝基化修饰可能是导致神经细胞损伤和神经退行性疾病的重要分子机制，为神经退行性疾病及蛋白质堆积异常相关疾病的治疗提供了新的思路。蛋白质巯基亚硝基化修饰与糖尿病2005年，有研究表明蛋白质巯基亚硝基化修饰与 II 型糖尿病关系密切。以 NO 供体GSNO处理肌细胞，胰岛素受体亚基( insulin receptor b

29、eta subunit，IR) 和蛋白激酶PKB/Akt均发生巯基亚硝基化，酶活性降低。胰岛素受体底物 (IRS-1) 也快速发生亚硝基化，且蛋白质水平在长期 GSNO 处理下降低。在饮食诱导肥胖和基因 ob/ob 缺陷的糖尿病鼠这两种不同胰岛素抵抗模型中，诱导型 NOS (iNOS) 的表达增高，肌细胞中 IR、IRS-1和 Akt 的亚硝基化水平均提高；而抑制 iNOS 的表达，这些蛋白质的亚硝基化被抑制，且胰岛素利用率在两种模型中都得到提高。研究还同时发现：iNOS 表达升高导致的胰岛素受体底物 IRS-1 蛋白质表达的降低是通过 IRS-1 亚硝基化实现的，其通过蛋白质水解酶介导的降解增加，成为胰岛素抵抗的一个重要因素。相反，葡萄糖激酶 GK (Glucokinase) 被亚硝基化后的构象发生变化，与分泌型颗粒(secretory g