先天性巨结肠症原癌基因RET结构的PCR-SSCP分析

1、    先天性巨结肠症原癌基因RET结构 的PCR-SSCP分析        摘要目的： 明确中国散发先天性巨结肠症是否有原癌基因RET突变。 方法： 30例中国散发先天性巨结肠症。 提取基因组DNA； 聚合酶链反应(PCR)扩增RET基因第6、13、15、17外显子； 单链构象多态(SSCP)分析上述外显子是否有突变。 结果： 6例长段型先天性巨结肠症， 2例有RET基因突变； 普通型及短段型未见RET基因突变。 2例突变位点均是RET基因的第13外显子。 结论

2、： 中国散发先天性巨结肠症长段型有RET基因突变， 提示原癌基因RET与先天性巨结肠症的发生有关。关键词Hirschsprung病致癌基因PCR-SSCP Analysis of RET Proto-oncogene in Hirschsprung's DiseaseWu Jun, Wang Huizhen, Ji Shijun, et al. Dept. of Pediat. Surgery, The 2nd Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110003.AbstractObjective: To inv

3、estigate the mutation of RET Proto-oncogene in sporadic Hirschsprung's disease (HD) in Chinese population. Methods: Genomic DNA was extracted from 30 unrelated HD patients. Exon 6, 13, 15, 17 of RET proto-oncogene were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and analyzed by single strand co

4、nformation polymorphism (SSCP). Results: RET mutations were detected in 2 of the 6 long-segment HDs. The 2 mutants were all in the exon 13. No mutations were detected in the ordinary or short-segment HD. Conclusion: The RET proto-oncogene plays an important role in the pathogenesis of HD.Key wordsHi

5、rschsprung's diseaseOncogene先天性巨结肠症(Hirschsprung's disease, 简称HD)是小儿外科常见的消化道畸形。 导致直肠、 结肠痉挛段神经节细胞缺如的原因说法不一。 近两年发现原癌基因RET对消化道神经节细胞的发育起重要的作用1。 本文利用聚合酶链反应-单链构象多态(single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products, 简称PCR-SSCP)技术分析30例中国散发HD原癌基因RET第6、 13、 15、 17外

6、显子， 了解是否有RET基因突变及突变位点。 材料与方法1. 临床资料： 19851993年经我科手术治疗， 病理证实的HD 30例， 按Romeo分型标准2， 长段型(痉挛段超过结肠脾曲)6例， 普通型(痉挛段位于结肠脾曲至乙状结肠之间)18例， 短段型(痉挛段位于直肠)6例。 全部病例均为散发性， 近系亲属无HD患者， 无其他伴发畸形。2. 标本来源： 上述病例采取外周血25 ml， 肝素抗凝， -20冰箱保存备用。 采血前2周内全部患儿未接受外源输血。 同时取10例正常儿外周血作对照。3. 基因组DNA的提取： 外周血500 l， 置于1.5 ml Eppendorf管中， 加等体积的P

7、BS缓冲液稀释混匀。 离心弃上清液。 加TE缓冲液180 l， 10% SDS 20 l， 蛋白酶K 2 l。 50水浴2小时， 饱合氯化钠溶液抽提DNA。 TE溶解DNA沉淀。4. PCR(聚合酶链反应)扩增RET基因第6、 13、 15、 17外显子。(1) 引物序列： 扩增第6外显子的引物序列为： (Forwoard) 5'-ATTGTTGTGCCCCTACCTG-3'， (Reverse) 5'-CCCCAGACAGGCAATAGGTA-3'。 扩增第13外显子的引物序列： (Forwoard) 5'-CTCTCTGTCTGAACTTGGC-3&

8、#39;, (Reverse) 5'-TCACCCTGCAGCGGCCTTA-3'。 扩增第15外显子的引物序列如下： (Forwoard) 5'-GACTCGTGCTATTTTTCCTC-3', (Reverse) 5'-TATCTTTCCTAGGCTTCCCT-3'。 扩增第17外显子的引物序列： (Forwoard) 5'-TCACTGGTCCTTTCACTCTCT-3', (Reverse) 5'-GGGAGGGAATGCACACAGAT-3'。 PCR特异性扩增RET基因第6、 13、 15、 17外显子

9、， 产物长分别是： 200、 108、 123 bp和138 bp。 上述引物均在上海细胞生物研究所合成。(2) PCR反应条件： 93变性30秒， 60退火60秒， 72延伸30秒， 循环30周期后72延伸10分钟。 使用FDDK-I扩增试剂盒(复旦大学生产)， 总反应体积10 l， 含DNA模板100 ng， 各引物50 pmol， 0.8单位FD-DNA聚合酶及37 kBq(1Ci)的-32P-CTP。 基因扩增仪： 1109DNA扩增仪(北京新技术应用研究所制造)。(3) PCR扩增产物的SSCP(单链构象多态)分析： PCR扩增产物加甲酰胺反应终止缓冲液稀释3倍。 取3 l上样电泳。

10、 用0.5TBE缓冲液制备6%丙烯酰胺凝胶， 一组加10%甘油， 一组不加甘油， 分别在27和4两个条件下电泳。 将丙烯酰胺凝胶转移至滤纸片上， 真空抽干。 在暗室内放射自显影1224小时。结果PCR-SSCP分析是根据单链DNA扩增产物在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率变化来检测基因变异， 当PCR扩增产物中含有单碱基置换等变异时， 单链带型即有所改变， 发生泳动变位(mobility shift)。 经两次重复实验， 30例HD患儿及正常对照组10例， RET基因第6、 13、 15和17外显子的PCR-SSCP均获成功， 均可提供有效的判定信号。 30例HD患儿中， 2例长段型出现了代表D

11、NA变异的泳动变位， 两个带型均是在正常带型的基础上多一条变位的DNA泳带。 说明这种DNA突变是杂合性突变。 突变位点均是RET基因的第13外显子。 这种改变将导致其蛋白产物的细胞内酪氨酸激酶区氨基酸序列的改变。 普通型及短段型HD患儿RET基因的第6、 13、 15、 17外显子均未见异常(附表)。附表30例散发先天性巨结肠症患儿RET基因的PCR-SSCP分析结果病理类型RET基因外显子6外显子13外显子15外显子17正常带型泳动变异正常带型泳动变异正常带型泳动变异正常带型泳动变异长段型(6例)60426060普通型(18例)180180180180短段型(6例)60606060讨论19

12、88年Takahashi等3在进行DNA重组实验时发现了RET基因。 随后人们发现RET基因对内分泌肿瘤(如甲状腺髓样癌、 多发内泌瘤等)的发生起重要的作用。 原癌基因RET的致癌性已无可非议。 1994年以来， 国外几个研究机构发现原癌基因RET与HD有关。 Schuchardt等4利用基因工程技术将RET基因剔除， 制成RET纯合子缺失的鼠受精卵， 分娩时按预期比例(79/304)产生了RET基因纯合子缺失的小鼠， 其外观正常， 但生后1624小时均死亡， 除解剖发现肾脏发育不良外， 组织学检查食管、 胃、 小肠及大肠全部消化管内神经节细胞缺失， 免疫荧光单克隆抗体检查亦未见神经节细胞。

13、证明RET基因对肠神经系统的发育起决定性作用， 与HD的发生有不可分割的关系。 Edery等5对没有RET缺失的HD家系利用PCR-SSCP结合DNA测序技术检查RET基因编码区是否有突变或微小缺失。 19个被查家系均与染色体10 ql1.2区有连锁关系， 在6个家系查出有RET错义突变， 突变位点集中在第2、 3、 5、 6外显子， 导致RET蛋白产物的细胞外区氨基酸序列改变。 而正常对照组40例未见RET基因突变(P0.01)。 Romeo等2用同样的技术检查27例散发HD， 其中7例长段型中4例有RET突变， 分别位于第6、 13、 15、 17外显子， 导致蛋白产物的细胞内酪氨酸激酶区

14、氨基酸序列的改变。 上述两组研究对象均是欧美人， 本研究发现2例长段型中国散发HD亦有原癌基因RET突变， 突变位点均是第13外显子， 将导致其蛋白产物的细胞内酪氨酸激酶区氨基酸序列改变。 结合本组资料， 目前可以初步明确HD与原癌基因RET的具体联系是： 家族性HD RET基因突变位点均是RET蛋白产物的细胞外区段的编码区， 而散发先天性巨结肠症RET基因的突变位点均是RET蛋白产物的细胞内区段的编码区； 散发HD有RET基因突变的均是长段型， 而家族性HD有RET基因突变者可以是长段型、 短段型或是正常携带者。综合我们的结果及国外的报道， 散发性HD长段型大约50%有RET基因突变。 最近

15、的研究揭示RET基因这种杂合性突变可以导致其功能异常。 Pasini等6在Romeo的领导下， 利用基因转移技术， 将HD患儿突变的RET基因导入NIH3 T3和PC12受体细胞， 结果这些细胞的转化和分化能力大大降低， 酪氨酸激酶的活性也降低， 证明HD患儿突变的RET基因对NIH3 T3和PC12细胞的生长发育起抑制作用。参考文献1武君， 张学. 先天性巨结肠与原癌基因RET. 中华小儿外科杂志， 1996， 17：45-47.2Romeo G, Ronchetto P, Luo Y, et al. Point mutations affecting the tyrosine kinase

16、 domain of the RET proto-oncogene in Hischsprung's disease. Nature, 1994, 367: 377-378.3Takahashi M, Buma Y, Iwamoto T, et al. Cloning and expression of the RET proto-oncogene encoding a tyrosine kinase with two potential transmembrane domains. Oncogene, 1988, 3:571.4Schuchardt A, D' Agati V, Larsson-Blomberg L, et al. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor RET. Nature, 1994, 367:380-383.5Edery P, Lyonnet S, Mulligan LM, e