MG132对肝癌细胞BEL7402凋亡及超微结构影响的实验研究

1、MG132对肝癌细胞BEL7402凋亡及超微结构影响的实验研究 作者：曲春媚 李伯勤 刘倩 毛海婷 张玲【摘要】目的：探讨泛素蛋白酶体通路阻断剂MG132对肝癌细胞BEL7402细胞凋亡和超微结构的影响。方法：以5和10mol / L MG132分别处理人肝癌BEL7402细胞24和48h，用流式细胞术检测细胞凋亡；DNA片段分析进一步证实凋亡存在，Western 印迹检测Bax蛋白表达，比色法测 Caspase3活性变化，用透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果：随着MG132浓度的增加和处理时间延长，细胞凋亡率增加；细胞DNA抽提电泳发现特征性凋亡梯状条带；Bax蛋白表达增加；Caspase

2、3活化；电镜观察到典型凋亡细胞，线粒体等细胞器的形态变化与MG132浓度和作用时间有关。结论：蛋白酶体抑制剂MG132可诱导肝癌细胞BEL7402凋亡；线粒体损伤、Bax蛋白上调、Caspase3激活可能在MG132诱导BEL7402细胞凋亡起重要作用。 【关键词】癌，肝细胞・超微结构・MG132・凋亡 Effect of MG132 on ultramicrostructure and apoptosis of human hepatocelluar cancer cell line BEL7402 【ABSTRACT】Obj

3、ective:To explore the mechanism of the apoptosis of human hepatocellular cancer cells BEL7402 induced by MG132.Method:BEL7402 cells were treated with MG132,apoptosis rate was detected with flow cytometry (FCM),DNA fragment analysis was used for confirming the presence of apoptosis,expression of Bax

4、was dectected by Western blotting,the activity of caspase3 was determined by colorimetric assay,the morphologic change was observed by transmission electron microscope.Result:Cell apoptosis percentage of BEL7402 cell increased with raised concentrations and prolonged treatment of MG132,agarose elect

5、rophoresis showed marked ladder,expression of Bax was upregulated,caspase3 was activited,the typic structure of apoptosis cells was found,different features of ultrastructure changes of mitochondria and other organellae were observed in cells exposed to different concentration and treating time of M

6、G132.Conclusion:Proteasome inhibitor MG132 can induce apoptosis of BEL7402 cells,Bax protein and caspase3 and mitochondria injury were responsible for apoptosis of BEL7402 cell induced by MG132. 【KEY WORDS】Carcinoma,hepatocellular・Ultrastructure・MG132・Apoptosis 泛素蛋白酶

7、体途径是细胞内蛋白降解的一个主要途径，这些蛋白包括转录因子，肿瘤抑制蛋白，原癌基因等。抑制泛素蛋白酶体途径，可使细胞生长抑制甚至凋亡1。研究发现，蛋白酶体抑制剂可诱导多种肿瘤细胞凋亡24，本研究探讨蛋白酶体抑制剂MG132（ZLeuLeuLeuCHO）对肝癌细胞BEL7402凋亡及超微结构的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 MG132购自Calbiochem公司，RPMI1640培养基购自GIBCO公司，Bax单克隆抗体购自Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司，Caspase3CPP32 Colorimetric试剂盒购自 Biovis

8、ion公司。 1.1.2 细胞人肝癌细胞BEL7402由中国医学科学院药物研究所刘耕陶教授惠赠。培养液为RPMI1640(GIBCO)、10小牛血清，消化液为0.25胰蛋白酶。将细胞置于37、5CO2的培养箱中培养。 1.2 方法 1.2.1AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率 实验组：分别给予终浓度为5.0、10.0mol/L MG132（实验组1、2）的培养液。对照组：给予不含MG132的培养液。均继续培养24h、48h后，收集细胞，制备悬液，作PBS洗2次，采用AnnexinV和PI荧光染色、FACS定量分析细胞凋亡状况。根据结果，选出用于以下实验的干预浓度。 1.2.2

9、 DNA片段分析 收集经5.0mol/LMG132处理48h的细胞及对照组细胞，参照文献方法5提取细胞DNA，琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统成像。 1.2.3 Western印迹检测Bax蛋白表达 收集实验组1作用24，48h和对照组细胞，提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳后，转膜，然后用含一抗的封闭液室温孵育1.5h，用含辣根过氧化物酶标记的二抗的封闭液室温孵育1.0h，洗膜，二氨基联苯胺（DAB）显色，分析结果。 1.2.4 Caspase3(半胱天冬酶3)活性测定 取对数生长期细胞，收集实验组1作用24h和对照组细胞，按试剂盒说明

10、处理，置酶联免疫检测仪下测A值，405nm为检测波长，以A405为最终A值，代表Caspase3酶活性。 1.2.5 细胞超微结构观察 实验组1、2培养24，48h和对照组细胞H800透射电镜观察，拍照。 1.2.6 统计学处理 采用SAS 6.12软件系统，以方差分析和t检验进行统计学分析。 2 结 果 2.1 细胞凋亡率 见表1、图1。加MG132两组凋亡率高于对照组，凋亡率随药物浓度增加、随作用时间延长而升高。 2.2 细胞DNA片段检测结果 见图2。BEL7402细胞经MG132处理48h后出现凋亡特征性DNA梯形条带，对照组则无。 2.3 MG132对Bax蛋白表达的影响 见图3。结

11、果显示BEL7402细胞经MG132处理后Bax蛋白表达显著上调。 2.4 MG132对Caspase3活性的影响 实验组1作用24h测A405为0.300，对照组为0.068，表明BEL7402细胞经MG132处理后，Caspase3活性明显增加。表1 实验组与对照组调亡率比较 2.5 细胞超微结构观察结果 2.5.1 对照组（图4a） 人肝癌BEL7402细胞，体积大，圆形或椭圆形，细胞核质比高；细胞膜完整，微绒毛丰富并呈极性分布；细胞质内各种细胞器结构清晰，内质网、游离核糖体、线粒体以及高尔基复合体丰富；细胞核大，一般居中，圆形或椭圆形，常染色质丰富，核仁，数量多而肥大，多见23个，网团

12、状结构清晰，核膜或光滑平直或出现深的凹陷，呈分裂增殖状。符合肿瘤细胞基本形态特征。 2.5.2实验组 符合凋亡过程中细胞的基本特征。 实验组1作用24h组（图4b)：具有典型凋亡形态的细胞较少见，细胞微绒毛无明显减少，仍呈极性分布；整个细胞呈高电子密度，细胞质中线粒体数量没有明显变化，但存在分布不均，三五聚集，嵴减少，内质网扩张，已出现染色质颗粒状聚集。 实验组2作用24h组（图4c）：具有典型凋亡形态特征的细胞数量较前组增多，凋亡细胞微绒毛消失，细胞膜光滑；线粒体数量减少，嵴减少或缺失；核浓缩，核仁尚存，但已失去正常结构，染色质呈块状聚集。 实验组1作用48h组（图4d）：易见凋亡细胞，细胞

13、微绒毛消失，细胞膜一侧光滑，一侧外凸。膜包绕细胞成分以出芽、发泡等方式脱落下来，形成凋亡小体。线粒体数量明显减少，但体积增大，基质密度较低，嵴数量减少或缺失，胞核染色质进一步浓缩。 实验组2作用48h组（图4e）：多见整个细胞裂解成凋亡小体，似花朵状，凋亡小体电子密度更高，但细胞膜完整，内涵的亚细胞结构清晰，线粒体体积大，双层膜明显，嵴少许，内质网呈环状或螺旋状，可见核糖体。 3 讨 论 泛素蛋白酶体途径在细胞周期控制和肿瘤生长的相关蛋白的降解调节中起重要作用。由于肿瘤细胞生长增殖速度快，其蛋白合成及降解也快，故可作为靶点诱导细胞凋亡，治疗肿瘤6。MG132是醛类蛋白酶体抑制剂，可逆地抑制蛋白

14、酶体糜蛋白酶样作用，阻断其对蛋白底物的降解，抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡。 本研究用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳发现MG132可诱导肝癌BEL7402细胞凋亡。用Western印迹检测发现，MG132诱导BEL7402细胞凋亡时，Bax蛋白水平升高，可能与以下因素有关：（1）蛋白酶体活性抑制后，对Bax蛋白降解减少；（2）蛋白酶体对p53降解减少，而后者作为转录因子，要胞内堆积，可使其下游基因Bax表达增加7。Fan等发现MG132通过增加p53、Bax表达诱导胃癌细胞凋亡8，而Kim等用蛋白酶体抑制剂诱导视网膜色素上皮细胞凋亡时，Bax mRNA不增加，Bax蛋白水平升高9。Bax蛋白在胞

15、浆堆积，可形成活性二聚体，插入线粒体，使其内膜释放细胞色素C，活化Caspase3，启动细胞凋亡。本研究将MG132加入BEL7402细胞后Caspase3活化，推测MG132可能通过Bax活化线粒体细胞色素C途径诱导肝癌细胞凋亡。 细胞凋亡是一个连续动态的过程，最明显的证据是电子显微镜下观察到的一系列形态学变化10，11。透射电镜直观、准确，并可间接观察到凋亡过程及细节12。本研究利用透射电镜观察MG132作用后的肝癌BEL7402细胞，发现细胞出现一系列的凋亡形态学变化，尤以线粒体变化具特征性：起初线粒体分布有变化，数量无明显变化，嵴缺失；而后线粒体数量明显减少，体积增大，基质密度降低，但

16、绐终保持完整而清晰的双层单位膜，直至在凋亡小体中也同样无损。提示线粒体参与细胞凋亡全过程，与一般细胞死亡明显不同。MG132可能通过线粒体细胞色素C途径诱导肝癌细胞凋亡。细胞核出现典型凋亡形态改变，染色质聚集、边集，染色质块与内层核膜之间存有空隙，提示核纤层及核骨架蛋白降解。Caspase6可切割核纤层蛋白LaminA，Lamin解体、拓扑异构酶的降解使染色质失去核内的支撑和附着，核酸内切酶被Caspase3激活后切断DNA，使核小体之间发生断裂，在电泳下呈现阶梯状特点，在电镜下可以观察到由断裂的、没有骨架蛋白支撑的染色质聚集而形成的各种形态。fordrin和肌动蛋白被降解，使细胞膜和细胞骨架

17、受到影响，凋亡细胞形成多个小体；尚不清楚fordrin如何被活化10。在晚期凋亡中发现两种产生凋亡小体的方式：一种是从细胞一侧产生，另一种是整个细胞裂解产生，似花朵状，这些形态变化可能与凋亡时以上分子的活性有关。Fan等发现MG132诱导胃癌细胞凋亡时，细胞色素C水平升高，Caspase3和Caspase7活性也增加8。MG132诱导肝癌细胞凋亡时，可活化哪些Caspase，Caspase又是如何造成细胞凋亡的过程及两种产生凋亡小体的方式的机制等，待进一步研究。 参 考 文 献 1Zavrski I,Jakob C,Schmid P,et al.Proteasome:an emerging t

18、arget for cancer therapyJ.Anticancer Drugs,2005,16（5）：475481. 2Cervello M.Giannitrapani L,La Rosa M,et al,Induction of apoptosis by the proteasome inhibitor MG132 in human HCC cells:Possible correlation with specific caspasedependent cleavage of betacatenin and inhibition of betacateninmediated tran

19、sactivationJ.Int J Mol Med ,2004，13（5）：741748. 3Ishizawa J,Yoshida S,Oya M,et al.Inhibition of the ubiquitinproteasome pathway activates stress kinases and induces apoptosis in renal cancer cellsJ.J Oncol,2004,25(3):697702. 4Guzman ML ,Neering SJ,Upchurch D ,et al.Nuclear factorkappaB is constitutiv

20、ely activated in primitive human acute myelogenous leukemia cellsJ.Blood，2001，98(8)：23012307. 5Gong J,Traganos F,Darzynkiewicz Z.A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometryJ.Anal Biochem，1994,218（2）:314319. 6Chauhan D,Hideshima T,Anderson KC.Proteasome inhibition in multiple