微生物细胞的破碎ppt课件

1、第三章、微生物细胞的破碎l微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称为胞外产物。称为胞外产物。( (例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等菌产生的糖化酶等) )l还有许多是存在于细胞内还有许多是存在于细胞内( (例如青霉素酰化酶，碱例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等性磷酸酯酶等) )称为胞内产物。称为胞内产物。l对于胞外产物只需直接将发酵液预处置及过滤，对于胞外产物只需直接将发酵液预处置及过滤，获得廓清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，获得廓清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，l对于胞内产物，那么需首先搜集菌体进展细胞

2、破对于胞内产物，那么需首先搜集菌体进展细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进展细胞碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进展细胞碎片的分别。碎片的分别。 细胞壁的组成和构造细胞壁的组成和构造l 细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。 l 细胞膜使细胞内外坚持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受浸透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。细菌的细胞壁细菌的细胞壁l 几乎一切细菌的细胞壁都是由巩固的骨架肽聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的外形和强度。l短肽普通由四或五个氨基酸组成，如L丙氮酸D谷氨酸L赖

3、氨酸D丙氨酸。l肽聚糖键是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交替地经过l4糖苷键联接而成。短肽接在N乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，构成了网状构造。革兰氏阳性菌的细胞壁l革兰氏阳性菌的细胞壁较厚革兰氏阳性菌的细胞壁较厚151550 nm50 nm，肽聚，肽聚糖占糖占4040一一9090，其他是多糖和磷壁酸，其他是多糖和磷壁酸，l 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄1.51.52.0nm2.0nm，最外面还有一较厚的外壁层最外面还有一较厚的外壁层810 nm810 nm，外壁，外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。层主要由脂蛋白，脂多糖组成。l 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状构

4、造，破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状构造，其网构造的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网构造的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肤键的数量和其交联的程度，假设交联程度在的肤键的数量和其交联的程度，假设交联程度大，那么网构培育致密。大，那么网构培育致密。酵母菌的细胞壁酵母菌的细胞壁l主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄添加而添革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄添加而添加。加。l细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的外形成了细

5、胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的外形l覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，l再外面是由再外面是由1 1，6 6磷酸二酯键共价衔接而成网状磷酸二酯键共价衔接而成网状构造的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的复合物，它构造的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的复合物，它可以共价衔接到网状构造上，也可以不衔接。可以共价衔接到网状构造上，也可以不衔接。真菌的细胞壁真菌的细胞壁l大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物，葡聚糖主要以物，葡聚糖主要以1313键衔接，键衔接，某些以某些以l6l6键衔接，几丁质键衔接，几丁质以微纤维形状存在以微纤维形状存在, ,糖蛋白。糖

6、蛋白。l真菌细胞壁的强度和聚合物的网状构造有真菌细胞壁的强度和聚合物的网状构造有关关l它还含有几丁质或纤维素的纤维状构造，它还含有几丁质或纤维素的纤维状构造，所以强度有所提高。所以强度有所提高。细胞壁的构造和细胞的破碎细胞壁的构造和细胞的破碎l破碎细胞，必需抑制的主要阻力是网状构破碎细胞，必需抑制的主要阻力是网状构造的共价键。造的共价键。l在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的构造和组成显得特别重要，可用来作壁的构造和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的根据。为选择溶菌酶和化学方法的根据。 微生物细胞的破碎技术机械方法球磨机 高压匀浆器 X-

7、press法 超声波破碎 非机械方法 酶解浸透压冲击冻结和融化枯燥法化学法l球磨机球磨机l 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一同快速液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一同快速搅拌或研磨，使到达细胞的某种程度破碎。搅拌或研磨，使到达细胞的某种程度破碎。这些安装的主要缺陷是在破碎期间样品温这些安装的主要缺陷是在破碎期间样品温度迅速升高，经过用二氧化碳来冷却容器度迅速升高，经过用二氧化碳来冷却容器可得到部分处理。可得到部分处理。球磨机球磨机l高压匀浆器高压匀浆器l 采用高压匀浆器采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的是大规模破碎细胞的常用方法，利用

8、高压常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液经过迫使细胞悬浮液经过针形阀，由于忽然减针形阀，由于忽然减压和高速冲击撞击环压和高速冲击撞击环呵斥细胞破裂呵斥细胞破裂高压匀浆法 l适用于酵母菌、大肠杆菌、宏大芽孢杆菌适用于酵母菌、大肠杆菌、宏大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。 X-press法法一种改良的高压方法是将浓缩的菌体一种改良的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至悬浮液冷却至-25C至至-30 C构成冰晶构成冰晶体，利用体，利用500 MPa以上的高压冲击，以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰

9、晶体的磨损，包埋在冰破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。中的微生物的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保管率高，的保管率高，该法对冷冻该法对冷冻融解敏感的生化物质不融解敏感的生化物质不适用。适用。 超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为剧烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上呵斥了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处置的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容

10、易破碎，对酵母菌的效果级差。该法不适于大规模操作，由于放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。超声波破碎仪酶解法l利用酶反响，分解破坏细胞壁上特殊的键，利用酶反响，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而到达破壁的目的。从而到达破壁的目的。l优点：专注性强，发生酶解的条件温暖。优点：专注性强，发生酶解的条件温暖。l缺陷：酶水解费用较贵，普通只适用于小缺陷：酶水解费用较贵，普通只适用于小规模的实验室研讨。规模的实验室研讨。l溶菌酶是运用最多的酶，它能专注地分解溶菌酶是运用最多的酶，它能专注地分解细胞壁上糖蛋白分子的细胞壁上糖蛋白分子的-1-1，4 4糖苷键，使糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处

11、置后的细胞移至脂多糖解离，经溶菌酶处置后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂低渗溶液中使细胞破裂自溶作用自溶作用l是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。微生物本身产生的。l影响自溶过程的要素有温度、时间、影响自溶过程的要素有温度、时间、pHpH缓缓冲液浓度、细胞代谢途径等。冲液浓度、细胞代谢途径等。l自溶法在一定程度上能用于工业规模，但自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培育液过滤速度质的变性，自溶后的细胞培育液过滤速度也会降低。也会降低。 浸透压冲击l是

12、较温暖的一种破碎方法，将细胞放在高是较温暖的一种破碎方法，将细胞放在高浸透压的介质中浸透压的介质中( (如一定浓度的甘油或蔗糖如一定浓度的甘油或蔗糖溶液溶液) )，入到达平衡后，介质被忽然稀释，入到达平衡后，介质被忽然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于浸透或者将细胞转入水或缓冲液中，由于浸透压的忽然变化，水迅速进入细胞内，引起压的忽然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。细胞壁的破裂。l浸透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，浸透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处置，或合成受抑制或者细胞壁预先用酶处置，或合成受抑制而强度减弱时才是适宜的。而强度减弱时才是适宜的。 冻结

13、-融化法l将细胞放在低温下忽然冷冻和室温下融化，将细胞放在低温下忽然冷冻和室温下融化，反复多次而到达破壁作用。反复多次而到达破壁作用。l对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。能提高收率。l另外，还能够引起对冻融敏感的某些蛋白另外，还能够引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。质的变性。枯燥法l可采用空气枯燥，真空枯燥，喷雾枯燥和可采用空气枯燥，真空枯燥，喷雾枯燥和冷冻枯燥等。冷冻枯燥等。l空气枯燥主要适用于酵母菌。真空枯燥适空气枯燥主要适用于酵母菌。真空枯燥适用于细菌的枯燥。冷冻枯燥

14、适用于较不稳用于细菌的枯燥。冷冻枯燥适用于较不稳定的生化物质。定的生化物质。l枯燥法条件变化较猛烈，容易引起蛋白质枯燥法条件变化较猛烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。或其它组织变性。化学法l用酸碱及外表活性剂处置，可以使蛋白质用酸碱及外表活性剂处置，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。漏出来。l某些脂溶性溶剂也能作为化学处置的方法，某些脂溶性溶剂也能作为化学处置的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分别和回收化学物质的问题。分

15、别和回收化学物质的问题。 破碎方法的选择l选择适宜的破碎方法需求思索以下要素：选择适宜的破碎方法需求思索以下要素：l细胞的数量；细胞的数量；l所需求的产物对破碎条件所需求的产物对破碎条件(温度、化学试剂、温度、化学试剂、酶等酶等)的敏感性；的敏感性；l要到达的破碎程度及破碎所必要的速度，要到达的破碎程度及破碎所必要的速度，l尽能够采用最温暖的方法；尽能够采用最温暖的方法；l具有大规模运用潜力的生化产品应选择适具有大规模运用潜力的生化产品应选择适宜于放大的破碎技术。宜于放大的破碎技术。 破碎率的评价破碎率的评价 l破碎率的评价破碎率的评价l细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞细胞破碎率定义

16、为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：数量的百分比数，即：l Y(%)=(N0-N)/N0100lN0原始细胞数量原始细胞数量 lN经经t时间操作后保管下来的未损害完好细胞数时间操作后保管下来的未损害完好细胞数量量l 目前目前N0和和N主要经过下面的方法获得主要经过下面的方法获得 各种破碎方法的评述各种破碎方法的评述 l高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处置高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处置量大，速度非常快，目前在工业生长上运量大，速度非常快，目前在工业生长上运用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易产生大量的热量，

17、使料液温度升高，而易呵斥生化物质的破坏，特别是在超声波处呵斥生化物质的破坏，特别是在超声波处置时。因此，超声波振荡法主要适用于实置时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。验室或小规模的细胞破碎。l 各种破碎方法的评述各种破碎方法的评述 l非机械法普通仅适用于小规模运用。浸透压冲击和冻结融解法都属于较温暖的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来运用，提高破碎效果。枯燥法属于较猛烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性. 破碎方法的选择根据破碎方法的选择根据l处置量处置量l高压匀浆和珠磨机处置量大，速度快，适用于工业消费高压匀浆和珠磨机处置量大，速度快，适用于工业消费l产物对破碎条件温度、化学试剂、酶等的敏感性以及产物对破碎条件温度、化学试剂、酶等的敏感性以及产物在细胞中的位置产物在细胞中的位置l生化物质的稳定性生化物质的稳定性l细胞的数量和细胞壁的强度细胞的数量和细胞壁的强度l破碎程度破碎程度l提取分别的难易提取分别的难易l总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进展权衡。能耗和便于后续提取这三方面进展权