反相色谱柱的清洁和再生

1、反相H PL C柱子得清洁与再生反相色谱就是迄今在高效液相色谱中应用最广泛得技术主要就是因为它适用于分析极人 多数得非极性物质与很多得可离子化得及离子化合物人多数用于反相色谱得固定相都就是天然 得疏水物质，W此.分析物就是按照它们与固定和得疏水相互作用得人小来分离得，含有疏水得 机制也能以同样得保留方式分离。硅胶农面因为有着疏水键介相而有些别得化学性质。残留得硅烷醇存在于所有得硅胶键 合填料中。图1描述了不同种类得能出现得硅烷醇，这些硅烷醇具有弱酸性，W此能与某些待分 析物合基质成分，特别就是碱性成分。因为硅烷醇得pKa值人约就是4、5,离子化能在中性pH 条件下发生W此与阳离了产生静电相互作

2、用就有可能发生。较老得A型硅胶能容纳高浓度金属离 予（有时候lOOppm或更多），而这能使硅胶农而得酸性更人甚至能发生金属螫合现象或淸除些化合物残留硅烷醇在非末端封闭得硅胶合短链键合相如C2或C4上更让人烦恼。b使用者 必须清楚她们所用得固定相农而特殊性质与可能得分析物一固定相衣而得相互作用，这样当她们 使用反相方法时才能考虑到可能得基质相互作用。例如，非常疏水得样品基质如玉米油，高芳香 物质，与蜡能粘住固定相装填衣面并且改变她们得性质。含有蛋白质物质得生物流体也能吸附在装填衣而。尽管分析者想尽最大努力来保护HP L C柱&某些分析物基质污染能使固定相受到有害得影响。b当柱子被污染，它

3、得色谱行为与没被 污染得柱了会有些不同。被污染得柱了能产生反压问题-彼污染得反相柱子必须清洗与再生才 能恢复原来得操作条件这部分得''柱了观察将讨论可行得方法使柱了回复原来得或差不多原来 得状态.因为键合硅胶柱了就是最受欢迎得,我重点讲述这种柱子。最后，我将讨论别得反相柱了得 清洁步骤。i反相柱了污染原因:通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣得东西盐、脂质.含脂物质、腐质酸.疏水蛋 白质与其它一些生物物质就是一些可能在使用时与HP LC柱发生相互作用得物质这些物质有比分析者得目标物或少或大得保留值。那些保留值较小得物质如盐类一般来说在空体积时就被冲 出色谱柱这些非目标产物得

4、干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者就是 负峰。如果样品成分在柱了中有很强得保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多 次上样后，这些吸附在柱了衣面得物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才 能发现。有着中等保留值得样品能彼缓慢洗出而且农现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。有时候这些彼吸附得样品成分累积到一定程度足以使她们开始形成新得固定相。分析物能与这些 朵质作用形成一定得分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现如果足够得污染产生，柱了得反 压能超过泵所能承受得最大压力，使柱了无法工作以及在堵塞处产生空体积加清洗硅胶键合柱子>再生被污染HPLC柱子得

5、关键就是知道污染物得性质并且能找到适当得溶剂来去除。如 果污染就是因为重复进样时强保留物质得累积引起得利用简单得步骤来除去这些污染物往往能 恢复其色谱行为有时候，经过多次操作以后得色谱柱用90- 1 0 0 %得溶剂B（双溶剂反相系统中较强得溶剂）冲洗2 0个体积可以清除污染物。（衣2列举了不同规格得HPLC柱子得空体积.W此读者能方便地确定和应柱了冲洗得体积。例如，柱了中残留得脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢咲喃如果您使用得就是缓冲液系统，不箜直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机 溶剂可能会使H P L C流动体系中得缓冲液沉淀这样会导致更人得问题如柱头堵塞、管道堵塞.泵活塞损伤或进样

6、阀转轴失灵应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗510个体积以后才更换强溶剂。有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上得污染物洗抻。那么更强得溶剂或者就是一系列 洛剂就有必要用来清洗柱了乐，如果污染物就是非生物物质，使用者可以跳过个或多个另外得 有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间得组合有很多。到柱了厂家得网页上能找到推荐得溶剂系 统。一般来说所有得清洗方法都有类似得形式所用得溶剂都就是随溶剂强度增加，经常最后一个溶 剂就是非常疏水得（如醋酸乙陆甚至就是婭），可以用来溶解非极性物质如脂质与油类我们必须 保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。淸洗过程要结束时，必须借助一个中等强度 能S

7、混得溶剂而回到原始溶剂系统例如，异丙醇就是个非常好得作为中间步骤得溶剂，因为 它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂S溶但就是异丙醇粘度非常人.必须确保较低得 流速以免使泵压过高。当然,如果使用紫外检测器得话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使 用大量得溶剂冲洗才能使基线平稳。b对于典型得硅胶键合柱來说如果没冇缓冲溶液得话推荐使 用以下溶剂系列:10 0%甲醇100%乙晴75b%乙晴25%异丙醇 10 0异丙醇ibO 0%一氯甲烷iOOb%正己烷e用一氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂和容性柱/必须用界丙醇冲洗后才能用原来得水相溶剂-每种溶剂至少冲洗W个柱体积.如2 50mmx 4. 6mmHP

8、LC分析柱，分析者可以用12ml/min得流速来冲洗，耍回箜原來得溶剂体系，不需耍每步都冲洗，可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没有缓冲得流动相, 最后回复起始流动相配置。四氢咲喃就是另外一种比较受欢迎得去除污染得溶剂。如果使用者怀 疑柱了彼严重污染，可以二甲基亚视（DMSO）或者二甲基甲酰钱与水按5 0:50得比例混合用低于0、5ml /min得流速流过色谱柱。成功再生反相柱了就是个非常耗时间得过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作ab还有一个问题就是清洗过程中就是否可以把HPLC柱了反过来。W为大多数强保留得污染物都会累积在柱头，把柱了反过来可以缩短污染物被冲出柱子得移动距离

9、。考虑到装填柱了得稳定性，现在人多数HPLC柱子都就是比普通操作压力大很多紂高压装填 得，W此她们得柱床应该不会受到反方向流速得影响。但就是，如果头上得烧结比尾部得烧结孔 径大得话。例如尾部烧结得孔径就是2|jm她通常能够留住平均5|jm孔径里得填料。有时侯厂 家会让头部孔径较人以避免样品或流动相颗粒堵塞如果这种孔径人于装填颗粒尺寸分布曲线得 最小粒径时，有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱，这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志 建议得流动方向，我建议通过操作手册与说明书'厂家主页或者技术支持部门等确认就是否可以 把柱子反过来冲。无论您就是否把柱了反方向，最好不耍让溶剂通过检测器避免污

10、染物与穿透缝 隙得颗粒进入检测池，否则有可能引起污染。血清洗柱了频率主要验有多少强保留物质彼打入色谱 柱。W为反相柱有时候在分辨率消失或者鬼峰出现前能欢受很人得污染，使用者经常会等到出现 了异常情况才开始注意。然而，污染物过多得累积会导致清洗柱子得难度加犬。所以，如果您知 道经常用杂质较多得样品上样时，我建议您们有规律地清洗柱了，您越就是频繁清洗柱了.就清洗起来就越不费劲。3清洗硅胶键合反相柱得蛋白质残余b如果就是生物物质如血浆或血清等积累在反相色谱柱上，操作者必须采用不同得淸洗程存人部分情况下，纯有机溶剂如乙晴或甲醇不溶解多肽 与蛋白质因此不能有效地清洗柱了。然而,有机溶剂与缓冲液.酸.离了

11、对试剂等得混合物则能 有效地溶解。开始，先开始尝试用百分比含量高得高强度溶剂（溶剂B）冲洗i体积。Frei $ er与她得合作者发现重复变化三氟乙酸水溶液与三氟乙酸一丙醇之间梯度得高低可以再生彼污染得反相柱了。Bha dwaj与Day认为在250 mmx4 6 mm得柱了中注入lOOpL得三氟乙醇就能起到效果。如果上述几个方法都不成功，Cuni co与她得同事推荐了几种强溶剂与增溶剂来除去黃白质（见衣三）。在使用这些溶剂之前，可以先咨询柱子得厂商确保这些溶剂能与柱子得填 料相容硅胶基质得柱了通常来说都就是相容得，但有机聚合物基质得柱了可能会在某些溶剂组 合中膨胀或收缩'这样会影响其色谱

12、行为。当用前述得溶剂系列时，确保衣三所捉到得溶剂能与系列中得溶剂互混对每个溶剂系统至少要 冲洗20体积。由于有些溶剂系统黏性很人，冲洗得流速应该相应调整以确保不会超过泵压用完 脈或尿等溶剂侯，至少应该用40-50体积得HPLC级水来冲洗柱了。对于反相柱子，不建议用衣面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）与三硝基甲苯，伙I为这些化合物必然 会牢固吸附在硅胶键合相柱了上很难除去。用衣而活性剂会影响装填衣而而改变其性质然而有 一个分离小组得研究衣明由某个小组做得污染后得柱了可以用5 0 0 pLi% S DS溶液用Iml/min得流速清除下多肽合成产物。如果继续用从5%9 5%含1%（V/V）三氟乙酸御

13、乙晴梯度洗脱.可以恢复多肽得分离4b清洗反相柱得待殊技巧 有时候，用有机溶剂清洗污染柱了并不能成功。如果金属离了吸附在硅胶或键合相上这种情况更 有可能发生。用鳌合剂如0、05M乙二胺四乙酸（ED1A）通过色谱柱时，含有很多金属离了得ED7A 复合物能溶解她们。用完EDTA溶液后.分析者一定耍用水完全冲洗柱了。如果样品含有离子 化合物，变化P H可以使她们转为非离了状态，这样她们就可以被水有机溶剂混合物洗脱下来.例如，强碱性物质能在pH低于3时被除去，在这个条件下质了钱变得水溶性更好酸性物质能在pH调整到人于其pKa时被洗下来一人约时pH8或9.这个状态酸性物质处于离了状态。然而,要注意硅胶柱了

14、在长时间处于高P H条件下容易彼破坏。要避免缓冲液或用缓冲液保存得柱了长菌，可以用普通家用漂口剂1:10或1： 20来冲洗。在这之间至少要打5 0体积色谱纯得水。不能让漂白水通过检测器，因为漂口水会腐蚀检测池。避免溶剂瓶中缓冲液长菌，每次只取足够得缓冲液用.把没用得保存在冰箱里，添加0、1%叠氮化钠 在缓冲液中，用缓冲液保存得柱子不能长期不用。色谱工作考经常会讨论到离了对色谱中离了对试剂对固定相得影响。显然离了对试剂如辛烷一礎 酸（用于阳离了）与四烷基钺澳（用于阴离了）在一定浓度得有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键 介柱了上。柱了因此彼污染很难回复到起始状态，因此人们都认为任何用于离了对得柱了都

15、会被 破坏而且用于不能再用于普通得反相色谱q Bid ling me yer不同意这种观点，她认为用于离了对色谱苛刻得pH值会通过水解键合相与在酸性条件下（pH 1-3 ）硬化硅胶或在高pH条件h（ P H7-8）溶解硅胶使一些柱了得性质改变。耍清除离了对试剂中御确酸，她建议首先用相同得没有离了对得缓冲液（至少20体积）冲洗然后用没有缓冲液得流动相（在清洗过程中甲醇 可能比乙晴更有效;如果就是长链得离了对试剂，用四氢咲喃）。很明显，确酸离了对试剂与鞍离 子对试剂有着不同得衣现.B i dlingmeyer与她得合作者证明了在C18柱了上用流动相浓度大于70%得甲醇，长链离了对试剂,SDS不会吸附在固定相上这个发现跟分离组得结果-致。硅胶键合整体柱如Ch romo lith柱了（默克公司,德国）可认为跟别得硅胶柱样.血结论:反相柱了会W为重复注入含有强保留物质特别就是分了量人得或疏水得样品而被污染，生