一株牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其分离方法及应用

1、说 明 书 摘 要本发明公开了一株牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其分离方法及应用，所述的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15已于2016年1 月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60008。本发明分离筛选提供的牡丹内生解淀粉芽胞杆菌是一株优良的植物内生防病促生菌，该菌株的发酵液对盆栽牡丹具有良好的防病作用，同时有具有较好的促生作用，该生防菌株兼具防病和促生作用，通过在牡丹温室栽培上的应用，既可以改善牡丹的生长状况，又可以有效的控制病害的发生率。本发明改变了牡丹病害的传统防治方法，采用生物防治的方法进行牡丹病害的防治，可以

2、减少化学防治对土壤及环境造成的伤害，同时降低牡丹灰霉病菌抗药性的产生，降低牡丹栽培管理中用于病害防治的成本。摘 要 附 图权 利 要 求 书1. 一株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15，该菌株已于2016年1 月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60008。2. 一种分离纯化解淀粉芽胞杆菌的方法，其特征在于包括：步骤1：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后在无菌条件下用质量百分比浓度为70%的酒精浸泡，之后将根皮消毒、冲洗，在确定所述的消毒方法有效后将根皮晾干作为样品，备用；步骤2：将样品放入无菌研钵中研磨成匀

3、浆，之后向匀浆中加入无菌水，混匀后静置制得混合液，备用；步骤3：把混合液转入大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）平板上，在温度为30的条件下培养2天后，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上纯化，即获得所述的解淀粉芽胞杆菌。3. 根据权利要求2所述分离纯化解淀粉芽胞杆菌的方法，其特征在于：步骤1中消毒根皮的方法是将根皮置于质量百分比浓度为20%的次氯酸钠中消毒5-10min。4. 根据权利要求2所述分离纯化解淀粉芽胞杆菌的方法，其特征在于：确定所述消毒有效的方法是随机抽取消毒后的根皮置于TSA平板上培养，48h后观察TSA平板，若培养基上没有菌落生成，则消毒有效；若培养基上有菌落生成，则消毒无效。5.

4、 一种测定解淀粉芽胞杆菌对牡丹灰霉病菌拮抗作用的方法，其特征在于包括：确定实验组和对照组，在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）中央处接种牡丹病原灰霉菌菌丝块，其中，实验组在距培养皿边缘处对称点接解淀粉芽胞杆菌，对照组只接病原菌菌丝块，在温度为28°C的条件下恒温培养5天后，待对照组菌丝长满平板时，测量实验组的抑菌带宽度，根据抑菌带宽度的大小确定解淀粉芽胞杆菌对牡丹灰霉病菌拮抗作用的强弱。6. 如权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌在防治盆栽牡丹灰霉病菌中的应用。7. 一株防治牡丹灰霉病菌的生防菌，其特征在于包括权利要求1-6中任一项所述的解淀粉芽胞杆菌。1说 明 书一株牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其

5、分离方法及应用技术领域发明创造明属于生物技术领域，特别涉及一种牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其分离方法及应用。背景技术河南洛阳是牡丹栽培面积最大、种质资源最丰富、以牡丹观赏和药用为一体的规模化、产业化研究基地。随着牡丹栽培面积的迅速扩展与品种的增多，牡丹病害种类逐年增多，危害愈来愈重。由于牡丹病害的蔓延造成大量牡丹植株长势衰弱、花色衰退、丹皮产量低、品质差、造成了人力、物力与财力的严重浪费，是牡丹栽培中急需解决的问题。目前危害牡丹的病害主要包括牡丹灰霉病、牡丹红斑病、牡丹黑斑病和牡丹根腐病等，目前病害的防治主要以化学防治为主，但是使用药剂不仅污染环境，而且容易导致病菌产生抗药性，而不得不每年增加化学

6、药剂的使用，从而导致防治成本累年增加，造成人力、物力和财力的极大浪费。因此，开辟新的防病措施已成为当务之急，而生物防治以其无毒无残留等优点给牡丹病害的防治带来新的希望。近年来研究表明，植物内生细菌对植物病原菌具有较好的抑制作用，这些内生细菌不仅能稳定定殖于植物体内，不易受外界环境的影响，而且对植物具有固氮、促生、抗旱等生物功能。利用内生细菌对植物病害进行生物防治，一方面能够避免使用化学杀菌剂在杀死病原菌的同时可能杀死在环境中起重要作用的非靶标微生物，另一方面可以避免使用其他生物菌肥带来的植物根际土壤微生态平衡的破坏，从而促进植物对恶劣环境的适应和保证寄主植物健康生长。因此，植物内生细菌作为新的

7、生防资源，发展迅速，成为当前植物病害生物防治研究的热点。由于目前关于牡丹内生细菌的研究非常有限，同时关于牡丹病害生物防治的研究较少，因此在实际生产中，牡丹病害的防治仍旧以传统的防治方法为主，造成牡丹病害防治成本的累年增加，因此迫切需要为牡丹病害的防治寻找新途径和新方法。由于内生细菌定殖于植物内部，所以牡丹内生细菌是理想的候选生防菌。目前植物内生菌研究已成为国内外研究的热点，而有关牡丹内生细菌的防病促生作用未见报道。发明内容本发明的主要目的在于提供一株牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其分离方法及应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：一种解淀粉芽胞杆菌（Bacillu

8、s amyloliquefaciens）Mdgb15，该菌株已于2016年1 月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号是GDMCC NO ：60008。本发明提出了一种分离纯化解淀粉芽胞杆菌的方法，包括：步骤1：从生长状态良好的牡丹根上剥取根皮，之后在无菌条件下用质量百分比浓度为70%的酒精浸泡，之后将根皮消毒、冲洗，在确定所述的消毒方法有效后将根皮晾干作为样品，备用；步骤2：将样品放入无菌研钵中研磨成匀浆，之后向匀浆中加入无菌水，混匀后静置制得混合液，备用；步骤3：把混合液转入胰蛋白胨培养基（TSA）平板上，在温度为30的条件下培养2天后，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上纯化，即

9、获得所述的解淀粉芽胞杆菌。在一些较为具体的实施方案之中，步骤1中消毒根皮的方法是将根皮置于质量百分比浓度为20%的次氯酸钠中消毒5-10min。在一些较为具体的实施方案之中，确定所述消毒有效的方法是随机抽取消毒后的根皮置于TSA培养基上培养，48h后观察TSA培养基，若培养基上没有菌落生成，则消毒有效；若培养基上有菌落生成，则消毒无效。本发明还提出了一种测定解淀粉芽胞杆菌对牡丹灰霉病菌拮抗作用的方法，包括：确定实验组和对照组，在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）中央处接种牡丹病原灰霉菌菌丝块，其中，实验组在距培养皿边缘处对称点接解淀粉芽胞杆菌，对照组只接病原菌菌丝块，在温度为28°C的条件

10、下恒温培养5天后，待对照组菌丝长满平板时，测量实验组的抑菌带宽度，根据抑菌带宽度的大小确定解淀粉芽胞杆菌对牡丹灰霉病菌拮抗作用的强弱。本发明还提出了将所述的解淀粉芽胞杆菌在防治牡丹灰霉病菌中的应用。此外，本发明还提供了一株防治牡丹灰霉病菌的生防菌，包括所述的解淀粉芽胞杆菌。与现有技术相比，本发明的优点包括：1. 本发明分离筛选提供的牡丹内生细菌解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15 GDMCC NO ：60008 是一种优良的内生防病促生菌，该菌株的发酵液对盆栽牡丹具有良好的防病作用，同时有具有较好的促生作用，该生防菌株兼具防病和促生作用，通过在牡丹

11、温室栽培上的应用，既可以改善牡丹的生长状况，又可以有效的控制病害的发生率，具有良好的技术效果。2. 本发明改变牡丹病害传统的防治方法，采用生物防治的方法进行牡丹病害的防治，可以减少化学防治对土壤及环境造成的伤害，同时降低牡丹灰霉病菌抗药性的产生，降低牡丹栽培管理中用于病害防治的成本。3. 本发明提供的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15培养条件简单、繁殖速度快、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。附图说明图1是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株的菌落特征和菌体特征。其中，A图是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株的菌落特征，B 图是菌体革兰氏染

12、色结果，C图是芽孢染色结果；图2是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株对牡丹灰霉病菌的拮抗作用结果图。其中，A图是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株，B 图是对照（CK）；图3 是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵液对对离体牡丹叶片灰霉病菌的抑制作用结果图。其中，A图是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵液，B 图是清水对照（CK）；图4 是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵条件优化后对灰霉病菌的拮抗作用结果图。其中，A 图是发酵条件优化后，B 图是发酵条件优化前；图5 是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵液对盆栽牡丹防治结果图。其中，A图为浇灌解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵液的盆栽牡丹，B图为浇灌清

13、水的盆栽牡丹；图6 是解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵液对盆栽牡丹促生长作用结果图。其中，A图浇灌解淀粉芽胞杆菌Mdgb15菌株发酵液的牡丹根系，B图为浇灌清水的牡丹根系。具体实施方式鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。实施例1：牡丹内生细菌Mdgb15分离和对牡丹灰霉病菌（Botrytis cinerea）的平板抑菌作用。本发明于2014年4月在河南省洛阳市隋唐城遗址植物园内采集牡丹植物的根部组织，具体的分离纯化操作步骤如下：将采集的新鲜牡丹根部组织在自来水下冲洗干净晾干，剥下外层根皮即为

14、丹皮，随机称取丹皮5g，在超净工作台内用70%酒精浸泡1min，再用20%次氯酸钠表面消毒5min-10min后，无菌水冲洗三次，随机抽取洗净的组织印记在大豆胰蛋白胨（TSA）培养基上，培养48h，观察有无菌落产生。并以此验证消毒方法是否能全部杀死供试材料表面的微生物，确定分离结果是否有效。样品晾干后转入无菌研钵中研磨匀浆，加10ml无菌水混匀，静置15min后，各取100µl汁液移入TSA平板上，每处理重复3次，30培养2d。定期观察分离平板，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基（NA）平板上纯化，获得牡丹内生细菌菌株。共分离纯化获得牡丹内生细菌65株，编号分别为Mdgb1-Mdgb65

15、。采用平板对峙培养法的测定牡丹内生细菌对牡丹灰霉病菌的平板拮抗作用，具体实施方法为在直径9cm的改良PDA培养基平板中央接直径为5 mm的牡丹病原灰霉菌菌丝块，在距培养皿边缘9mm处对称点接内生细菌菌株，对照只接病原菌菌丝块，28°C恒温培养5d后测量抑菌带的宽度，待对照长满整个平板时观察结果，每个处理重复3次。试验结果如图1所示，内生细菌菌株Mdgb15菌株对牡丹灰霉病菌具有强烈的抑菌作用，抑菌圈平均直径值为11.5mm。本实施方式中大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）由胰蛋白胨15g、大豆胨5g、NaCl 5g、琼脂17g和1000ml蒸馏水组成，pH7.3；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）

16、由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、琼脂17g和1000ml蒸馏水组成，pH7.2；改良PDA培养基由土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、琼脂17g和1000ml蒸馏水组成，自然pH值。实施例2：牡丹内生细菌Mdgb15的鉴定。本发明的实施主要采用菌体形态观察、生理生化特征测定和分子生物学手段相结合的方法对内生细菌Mdgb15进行鉴定。试验结果如图2所示，菌株Mdgb15在NA培养基上生长良好，其菌落平铺、干燥、不透明、白色，经革兰氏染色后，均为阳性，菌体为杆状，产生芽孢。16S rRNA的PCR扩增结果表明，菌株Mdgb15扩增产物为1511 bp，委托上海生工生物工程公司测序，获

17、得菌株Mdgb15 16S rRNA基因全序列，序列登录号分别为KU570451。利用GenBank中的BLAST软件对菌株的16S rRNA基因序列进行分析，菌株Mdgb15的16S rRNA序列与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens具有较高的同源性，其相似性都高达99%。结合形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株Mdgb15鉴定为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽胞杆菌Mdgb15 16S rDNA 基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。实施例3：解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amy

18、loliquefaciens）Mdgb15对离体牡丹叶片灰霉病的防病作用。在NB培养液中接种解淀粉芽胞杆菌Mdgb15，28°C、180r/min振荡培养18h，获得拮抗菌株的活菌悬液备用。在健康的牡丹植株上，采取生长良好且大小相似的叶片，用流水轻轻冲洗数次，然后在75%的酒精中浸泡30s，无菌水冲洗干净后，放在无菌滤纸上晾干。将拮抗菌株发酵液用无菌棉花均匀涂抹在牡丹叶片上，将叶片放入铺有无菌滤纸（滤纸用无菌水完全浸湿）的培养皿中，48h后在叶片上接种一块直径为6mm的灰霉菌菌丝块。以在无菌水中浸泡作为对照。每处理重复3次，25培养3d后，检查叶片发病情况，计算防治效果。防治效果(%

19、)=(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100。试验结果如表1和图3所示，解淀粉芽胞杆菌Mdgb15对离体牡丹叶片灰霉病有极好的防治效果。对照组牡丹叶片发病严重，病原菌菌丝茁壮，病部表面产生浓密灰色霉层，后期凡菌丝触及的地方叶片腐烂。与对照组相比，拮抗菌株处理叶片上出现较小水渍状病斑，无菌丝生长，生防菌对灰霉病的发生和蔓延起到了有效的控制作用，其病原菌接种后3d防病效果为44.23%，5d防病效果为37.25%。表1 解淀粉芽胞杆菌Mdgb15对牡丹离体叶片灰霉病的生防效果处理3d5d7d病斑直径（cm）防病效果（%）病斑直径（cm）防病效果（%）病斑直径（cm）防病效果（

20、%）Mdgb151.6144.232.2837.253.6126.88CK2.89-3.67-5.00-本实施方式中NB培养基由牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨5g和1000ml蒸馏水组成，pH=7.0左右。实施例4：解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15发酵条件的优化。本发明的实施主要采用单因素实验，分别改变发酵培养基中碳源种类、氮源种类、无机盐种类、初始pH、培养温度、摇床转速及培养时间，经培养后，测定菌株发酵液抑菌活性，抑菌活性的测定采用滤纸片法，以抑菌活性的大小判断生防菌株的培养条件。（1）发酵培养基的优化分别以1.0%的蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、

21、可溶性淀粉和玉米淀粉代替NB培养基中的碳源，其他成分不变。以4%的接种量将种子液分别接种到液体培养基中（250mL三角瓶装液100mL），在30、180r/min条件下培养48 h 后取样，采用滤纸片法测定抑菌活性，每处理3 次重复。根据抑菌活性最大时确定碳源的种类。在固定碳源的基础上，分别以1%蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、硫酸铵和氯化铵代替NB培养基中的氮源，培养条件同上，筛选抑菌活性最大时的氮源。在固定碳源和氮源基础上，分别添加0.5%的NaCl、CuSO4、CaCl2、MgSO4、ZnCl2 和Fe(SO4)26H2O用于筛选无机盐，培养条件同上，筛选抑菌活性最大时的无机盐。

22、（2）发酵条件的优化将含有最佳碳、氮源和无机盐的发酵培养基的初始pH值分别设为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和9.0；置于30下，180 r/min摇床振荡培养48 h后，采用滤纸片法测定发酵液的抑菌活性，确定抑菌活性最大时的初始pH值。调节含有最优发酵培养基的初始pH值为最佳，分别置于28、31、34、37和40，180r/min摇床振荡培养48h后，测定抑菌活性，确定抑菌活性最大时的培养温度。确定最佳初始pH值和培养温度，设定不同的转速为90、110、130、150、170和190r/min摇床振荡培养48h后，测定抑菌活性，确定抑菌活性最大时的摇床转速。将菌株接种到含有最佳碳、

23、氮源的发酵培养基中，调节pH值为最佳，置于最佳培养温度下，采用最佳摇床转速振荡培养。与接种后12、24、36、48、72 和96 h后分别取样测定抑菌活性，获得菌株最佳培养时间。试验结果表明，解淀粉芽胞杆菌Mdgb15发酵培养基中的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母提取粉，最佳无机盐为NaC1，其抑菌活性的最佳发酵培养基为：葡萄糖20g L-1，酵母提取粉1.0g L-1，NaCl 0.3g L-1；最适宜的培养基初始pH为6-7，最适培养温度为31，最适摇床转速为130r/min，培养24h后生物量达到最大值，抑菌活性最大时最佳培养时间为48h，在最佳培养条件下，如图4所示，菌株发酵液对牡丹灰

24、霉病病原菌抑菌带宽度可达到17.5mm。实施例5：解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15对盆栽牡丹的生防作用。本发明实施的试验材料为牡丹品种“赵粉”4年生实生苗，植株生长健壮、形态基本一致，无病虫害。将盆栽好的“赵粉”(土壤要求灭菌，盆高28cm，盆口直径31cm，盆底直径22cm)用生防菌液浇灌处理，每盆浇灌菌液20ml（OD600=2），72h后再接种灰霉病孢子悬浮液（孢子浓度为105/ml），每个处理3盆，设置3次重复，24-27保湿培养7d后调查发病情况，记录病情指数，计算防病效果。以清水处理接种病原菌为对照。灰霉病病害分级标准见下表。病情指

25、数=（各级病叶数×各级代表值）/(调查总叶数×最高级代表值)×100防治效果%=病原菌对照病情指数-单个处理病情指数病原菌对照病情指数×100表2 牡丹灰霉病病情分级病级病情描述0级全株叶片健康，无病斑1级全株1/4以下叶片发病，平均每个复叶上的病斑数在2个以下，病斑不连成片2级1/4-1/2叶片发病，平均每个复叶上有3-5个病斑3级1/2-3/4叶片发病，平均每个复叶上有6-10个病斑，斑点密集；或1/3以上叶片枯焦4级3/4以上叶片发病，平均每个复叶上有10个以上病斑，斑点密集并相连成片，或1半以上叶片枯焦5级全株死亡试验结果表明，解淀粉芽胞杆菌Md

26、gb15对盆栽牡丹灰霉病具有较好的防治效果，在病原菌接种5d、7d和10d后，浇灌生防菌Mdgb15的盆栽牡丹其病情指数显著降低，如表3和图5所示其防治效果分别为70.2%、72.2%、62.8%。与50%多菌灵可湿性粉剂500倍液的防治效果基本无差异，表明生防菌株Mdgb15有效的防治盆栽牡丹灰霉病。表3 生防菌Mdgb15发酵液对盆栽牡丹灰霉病的防治效果处理5d7d10d病情指数防病效果（%）病情指数防病效果（%）病情指数防病效果（%）50%多菌灵WP500倍液5.376.4a10.873.9a23.665.6aMdgb15菌株发酵液6.770.2a 11.572.2a25.562.8aC

27、K22.5-41.5-68.7-实施例6：解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15对盆栽牡丹的生防作用。本发明实施采用的试验材料为牡丹品种“凤丹白”2年生实生苗，植株生长健壮、形态基本一致，无病虫害。将盆栽好的“凤丹白”( 土壤要求灭菌，盆高28cm，盆口直径31cm，盆底直径22 cm)用生防菌液浇灌处理，每盆浇灌菌液20ml（OD600=2），以清水处理为对照。每处理重复3次。30d后晾干后量取株高和茎粗，观察其促生作用。试验结果表明生防菌株Mdgb15对盆栽牡丹具有明显的促生作用，如表4和图6所示，浇灌生防菌株Mdgb15的盆栽牡丹生长1个月后，

28、牡丹生长更快更健壮，叶片颜色深绿，株高显著增加，且根系更为发达，植株鲜重有显著增加。表4 生防菌Mdgb15发酵液对盆栽牡丹的促生作用处理株高（cm）新枝长度（cm）根颈粗度（mm）主根长度（cm）鲜重（g）Mdgb15发酵液328.5 5.8421.328.5CK23.54.44.851621.8本发明从牡丹根部分离获得了一株对牡丹灰霉病具有较好防效的生防内生细菌解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） Mdgb15，确定菌株抑菌活性最好的最优培养条件，明确生防菌株对于盆栽牡丹灰霉病的防治效果，同时了解生防菌株对盆栽牡丹的促生效果，从而为牡丹病害的生物防治提供了

29、新途径和新方法。以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。说 明 书 附 图图1图2图3波长图4图5波长图6序 列 表 说 明 书 SEQUENCE LISTING<110> 洛阳理工学院<120>一株牡丹内生解淀粉芽胞杆菌、其分离方法及应用<130> 20160202<160> 1<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 1511<212>

30、DNA<213>解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Mdgb15<400> 1 cggctacctt gttacgactt caccccaatc atctgtccca ccttcggcgg ctggctccat 60aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 120caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 180tcacgcagtc gagttgcaga ctg

31、cgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta 240acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 300aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 360ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 420aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccccc 480gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 540cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 600agtttcagtc