乙肝检测综述(新)

1、乙肝检测综述乙型病毒性肝炎（简称乙型肝炎）是由乙型肝炎病毒（简称乙肝病毒）引起的肝脏 炎性损害，是我国当前流行最广泛、 危害最严重的一种传染病。乙肝检测在乙肝病毒感染的诊断及献血员筛选上均有重要意义：1筛选供血员，通过检测 HBsAg，筛选去除HBsAg阳性的供血者，可使输血后乙肝发生率大幅度降低。2.可作为乙肝病人或携带者的特异性诊断。3.对乙肝病人预后和转归提供参考。一般认为急性乙肝患者，如HBsAg持续2个月以上者，约2/3病例可转为慢性肝炎。HBeAg阳性者病后发展成为慢性肝炎和肝硬化的可 能性较大。4.研究乙肝的流行病学，了解各地人群对乙肝的感染情况。5 .判断人群对乙肝的免疫水平，

2、了解注射疫苗后抗体阳转与效价升高情况等。随着科技的进步，免疫学和分子生物学等学科的不断纵深发展以及人们对乙肝病毒的 认识，乙肝检测的方法手段也不断的更新，特异性和敏感性（检出率）也有明显提高，而且也越来越自动化，在乙肝的诊断、治疗和控制乙肝病毒的传播方面作出了巨大的贡献。下面就具体介绍一下乙肝检测的历史、现状、以及未来的发展趋势。一、60年代一70年代我国在60年代末引入了免疫沉淀试验，开创了对乙型肝炎病毒抗原抗体的检测。我们 先后采用过琼脂免疫扩散，对流免疫电泳，免疫放射电泳自显影等方法，但其特异性及敏感性还较差。70年代初采用了一系列间接血凝试验（IHO）、免疫粘连血凝试验（IAHA），乳

3、胶凝集试验等，使检测的敏感性和特异性有所提高。Mancini （1965）提出单向免疫扩散技术（single immunodiffusion ）,此法是目前最常用 的简易抗原定量技术。单向免疫扩散试验是在凝胶中进行的沉淀反应，将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度（最低浓度） 约为1020卩g/m,常用于定量测

4、定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需12天才能看结果。此种方法由于灵敏度低，反应时间长，已经不用于乙肝检测。对流免疫电泳（cou nterimmu noelectro phoresis ）是一敏感快速的检测方法，即在电场作 用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极 侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体 分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动， 抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。虽然其反应时间相对于免疫

5、扩散技术大大缩短，但其灵敏度仍旧有限，小 于 0.1mg。由于免疫沉淀试验灵敏度有限，无法满足乙肝临床检测的需要，所以70年代人们采用了凝聚实验来代替它，其中有代表性的是反向被动血凝实验（R-PHA ）。其原理是：先将绵羊红血球以戊二醛固定，使其表面阴离子化，再经鞣酸或氯化铬（交联剂）理，使提纯的乙 肝表面体吸附到醛化红血球表面致敏，此致敏血球与表面抗原相遇，发生特异性抗原抗体反应而使血球凝集，称为反向被动凝集（RPHA ）。如果将含特异性抗体的待检血清与已知抗原先混合，使发生特异性抗原抗体反应而将抗原上的结合位点占据，此时加入抗体致敏血球就不能再与已知抗原起反应，因而不产生血凝，此法称为反向

6、被动血凝抑制（RPHI ）。反向被动血凝试验是用来检查抗原的，而反向被动血凝抑制试验则是用来检测抗体的。对流免疫电泳（CIEP）法和补体结合试验（CF）法比琼脂免疫扩散（ID ）法要敏感20100倍，可检测到每毫升中含有 1 微克以上的表面抗原颗粒。而反向被动试验（RPHA ）又比对流免疫电泳和补体结合试验敏感 10100 倍，可检出每毫升血清中所含的 0.1 微克以下的表 面抗原。虽然其灵敏度大大提高，但是卫生部在关于整顿血液制品生产管理的通知中指出， 要严格按照卫生部颁发的献血员体格检查标准 ，对献血员进行健康检查，关于标准 中HBsAg检查一项，应将灵敏度低的“反相间接血凝法（RPHA）

7、”改为灵敏度高的“固相放射免疫法（R I A）或“酶联免疫吸附法（ELISA）”。二、 80年代 90年代12。随我国于1983年建立分泌抗HBc IgM及lgG3的单克隆抗体的两个杂交瘤细胞系 后相继建立了分泌抗 HBs、抗HBe、抗前S2及抗HAV等单克隆抗体杂交瘤细胞株。这些 都迅速运用于多种检测方法和制备试剂盒的研究，显著地提高了检测水平。1994 年研制了HBV 前 S2（HBV PreS2） 基因工程单链抗体 （ScFv）14。 1995年又采用噬菌体抗体库技术，筛 选到抗 HBs 单抗 15 。双功能抗体检测等新技术的研究也初见端倪。随着单克隆抗体、人工合成多肽及基因工程表达抗原

8、、各种标记技术的出现，一系列超微量免疫学检测的研究迅速发展。固相放射免疫测定（SPRIA）及ELISA试验广泛应用于乙肝的检测，敏感度达到 ngfg/ml水平。放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA ）是以放射 性核素为标记物的标记免疫分析法， 用于定量测定受检标本中的抗原。 最初建立的方法模式 是以核素标记的抗原与受检标本中抗原竞争的测定模式，本法的灵敏度高达ng甚至pg水平,必须加以防护， 核素实 另外由于核素有半衰期， 试剂 但现仍普遍使用于县级以上乙肝病毒酶联免疫法诊断试 固相和酶标记的 把受检标本 （测定其中的抗体或抗原）和酶标 用洗涤的方法使固相载体上测定的准确性

9、良好，特异性强、精密度高、有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，在医学 检验中应用极为广泛， 但由于核素的放射性对人体有一定的危害性， 验室的建设须经防疫部门的监督， 操作人员须经过特殊训练。 盒的货存期较短， 因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处， 医院。酶联免疫法兴起于 20 世纪 80 年代， 产品现在处于成熟期，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的 底物被酶催化变为有色产物， 产物的量与标本中受剂盒市场上很普遍。 其基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记， 的抗原或抗体及酶均保持其活性。在测定时， 抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 形成的抗原抗体复

10、合物与其他物质分开， 量成一定的比例。 加入酶反应的底物后， 检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高， 故可极大地地放大反应效果， 从而使测定方法达到很高的敏感度。 虽然其灵敏度与放免相比 有限，适用于临床定性判定，但由于其检测方便，快捷，试剂稳定，成本低，无污染，而且 自动化程度高， 所以现在普遍使用于各级临床机构， 是检测各种肝炎病毒抗原抗体仍为较普 遍应用的重要诊断条件，也是我国临床免疫诊断的基本方法。化学发光法 20世纪 80 年代在国外已经兴起， 现已被临床普遍使用， 成为临床免疫诊断 的支柱方法。 但在国内， 目前仅有个别较大的医院开展个别项

11、目， 产品处于导入期或成长期。 其原理和酶联免疫法基本相同， 只是所用的底物为发光底物， 最后根据发光值来测定标本的 含量。 由于化学发光法既兼有酶联免疫法的各种优点， 又屏除了放射免疫法有污染， 操作不 便等缺点， 因此目前不但在技术上开始有了飞跃的进展， 而且高级仪器的自动化程度也越来 越高。相信化学发光法将会成为乙肝定量检测的方法中具有竞争力的一种，引起科研生产单位及用户的关注。免疫渗滤试验（DICA ）及核酸杂交法是继 EIA后较有前途的检测手段。90年代初发展 了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（ dotymmunogoldfiltrationassay ， DIGFA ），又名滴

12、 金免疫测定法（简称滴金法） 。其原理以双抗体夹心法为例，在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色， 阳性反应即在膜中央显示红色斑点。在滴金法中不需酶Me 抗 HBs，1 ng/ml。可 其试剂稳操作简对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。另外一种与此相近的技术是胶体金免疫层析技术，1997年采用胶体金标记以硝酸纤维素膜为载体进行层析检测HBsAg的技术，其特异性好，灵敏度可达DNA 或 RNAHBV

13、DNA存在就可以引起乙肝的传 而最早的直接检测病毒遗传物质 HBVDNA 作探针，与病人血清中 存在，则其碱基与探针的 HBVDNA以避免在ELISA(特别是一步法)等方法中出现的由于抗原过剩所导致的钩状效应。 定、易于保存，附有质控带可行质量监控，是适合基层单位检测肝炎病毒抗原抗体， 易快速、无须仪器设备的良好检测方法。肝炎病毒颗粒的存在与否决定了它的传染性的有无，而肝炎病毒特异性 是肝炎病毒是否存在的直接证据。另外，研究发现只要染。以上各种方法的共同点是不能直接检测病毒遗传物质， 的方法是斑点杂交法。用核素或生物素标记克隆化的 HBVDNA进行分子杂交，如病人血清中有HBV DNA相配对结

14、合并显色，则为阳性，表示有乙肝病毒感染，病毒在复制，有传染性。此法操作简 单，用血量少，价格较低，且病毒量要大于105拷贝/毫升才呈阳性，故灵敏度差。1985年PCR ( Polymerase Chain Reaction )出现， PCR技术应用于乙肝检测 是指将 病人血清中特异的 HBVDNA在内外引物的作用下，使其HBVDNA特异性片段在设定的条件下不断扩增到原来的数百万倍。PCR法直接检测病毒基因、具有高度的特异性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因而取代了斑点杂交、原位杂交、膜印迹杂交等基因检测技 术，迅速广泛地用于肝炎病毒的检测研究，是检测技术的一项革命性突破。在实验技术上不断

15、发展的套式PCR、原位PCR、链特异性PCR等也应用于体液及组织中肝炎病毒基因的检 测。目前，PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的 方法之一。 但PCR技术也不是十全十美的，因为其操作过程易被污染而致假阳性，且只能定性。目前已用于病毒性肝炎等多种病毒传染性疾病的病原诊断，考核抗病毒治疗效果，鉴定乙肝疫苗和血液制品的安全性，以及分析病毒基因变异等许多方面。1997年运用PCR扩增片段限制性内切酶片段长度及基因序列分析，报告了我国HBV DNA变异的研究结果。HBVDNA定量的方法包括酶标法和荧光法。酶标法是先用 PCR法将HBVDNA进行扩最终加底 PCR-E

16、LISA只能作为一种定性试验，但 荧光法是将荧光探针加人标本进行扩 根据标准荧光梯度曲线得出所测标本HBV-DNA含量的原理。PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的 5 '端报告荧光基团的激发光被 3 '端的淬灭荧光基团所 Tao酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合 将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，PCR产增，PCR引物5'端标记上地高辛或生物素等非放射性标记物，扩增产物滴加到固定有特异 性探针的微孔板上，再加入抗地搞辛或生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物， 物显色，在酶标板上测定 0D值判定结果。常规的 若加入内标，作出标准曲线也可实现定

17、量检测的目的。 增，动态观察荧光的变化并与标准荧光变化进行比较， HBVDNA的定量。荧光法比酶标法敏感而准确，应用较广。下面主要讲一下荧光探针疋量 PCR ( FQ-PCR)法准确定量检测已肝病人血清中的通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线， 得到每一样品模板 DNA ，无需PCR后处理和冗长的实时荧光定量PCR反应是在常规 寡核苷酸探针。在探针完好的状态下， 抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸， 位置，发挥它的5'73外切核酸酶活性， 每合成一个模板，一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和 物是一对一的关系。 找到PCR扩增的对数期。软

18、件通过标准品的待测品的对数期比较， 的起始拷贝数。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行 电泳、紫外或染色检测，解决了常规PCR实验不能准确定量及扩增产物污染而导致的假阳性操作繁复以及强烈致癌物溴化已锭对操作人员的危害和污染环境等问题.成为 PCR 的更新换代的技术。 但关于 FQ-PCR 能否作为一种定量 PCR 技术， 目前存在着两种完全对立的学派。三、未来趋势基因芯片是最重要的一种生物芯片， 是指将大量探针分子固定于支持物上， 然后与标记 的样品进行杂交， 通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。 用该技术可将大量的探针同时固 定于支持物上， 所以一次可对大量核酸分子进行检测分析， 从而解决了传统核酸印迹杂交技 术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析 大量的基因， 使人们准确高效地破译遗传密码。 这将是继大规模集成电路后又一次意义深远 的科技革命。 目前， 国际上正在研制多种基因芯片， 我国的超群基因芯片目前主要用于检测 乙型肝炎、 丙型肝炎和艾滋病病毒。 华声报讯：只需被检验者一滴静脉血液，一种芯片就可 利用四百多个探针对乙肝病毒基因的不同区域、 多个位点同时进行检测， 准确率达百分之百。 最近，这种只有几平方厘米大小、 却记载着四百二十九种乙肝病毒突变类型的基因芯片在南 开大学问世。 这种神奇的基因芯片 “乙肝病毒基因