2012CB517700-G慢性肾脏病进展的机制研究侯凡凡_修正版

1、修正版依托部门:广东省科技厅项目名称:慢性肾脏病进展的机制研究首席科学家:侯凡凡南方医科大学起止年限:2012.1-2016.8修正版、关键科学问题及研究内容1. 进展性肾脏病和肾纤维化的遗传因素及其致病机制利用已建立的人群样本，对中国常见慢性肾脏病进行全基因组关联分析（GWAS）；利用已建立的患者样本和家系样本，研究肾小球足细胞骨架蛋白基因突 变/多态性及其他基因突变与各种慢性肾脏病及其进展的关联，并针对易感位点进行功能研究；利用已建立的中国患者群样本，针对天然免疫补体系统和获得性免疫淋 巴细胞激活分子，探讨遗传易感基因与免疫性肾脏病发生发展的关联；研究营养因 素对基因组甲基化的影响及其在慢

2、性肾脏病进展中的作用，以揭示中国人进展性肾 脏病的高危人群和危险因素。2. 免疫性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制禾用已建立的中国患者群样本，以狼疮性肾炎、ANCA相关性肾炎、抗 GBM肾病为切入点，探索肾组织免疫炎症过程中关键的补体活化途径和沉积机制；研究 补体调节蛋白异常对补体系统功能的影响和导致免疫性炎症的机制；研究已确定的 致病自身抗体（如 ANCA和抗GBM抗体）所针对的关键抗原决定簇，并寻找与抗 原决定簇扩散有关的同源性蛋白或病原微生物，以揭示免疫性炎症在慢性肾脏病进 展中的促进作用及其分子基础。3. 代谢性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制借助细胞模

3、型和模式动物，系统研究炎症对肾脏细胞胆固醇重分布、肾脏泡沫 细胞形成和组织损伤的机制；研究蛋白质氧化损伤对肾细胞的病理生物学活性、作 用机制及对肾脏炎症和纤维化的影响；利用已建立的样本人群，研究叶酸缺乏和 Heys血症在慢性肾脏病进展中的作用及其分子机制。以阐明脂质代谢、蛋白质代谢 和氨基酸代谢紊乱在代谢性炎症及肾脏病变进展中的作用和分子基础。4. 肾脏内分泌激素对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控和机制利用髓样细胞特异性 MR基因敲除小鼠，阐明髓样细胞 MR在肾纤维化中的调 控作用及其机制；利用 VDR基因敲除小鼠，明确活性维生素 D对足细胞形态、功 能以及足细胞中间丝蛋白 Nest in表达的调

4、控作用；建立间质细胞特异性P GIS基因敲除小鼠，揭示 COX2-PGIS-PGI2通路在肾间质纤维化中的调控作用；利用 SIRT1 抑制剂分析 SIRT1对足细胞、髓样细胞和间质细胞由VitD/VDR、醛固酮/MR、COX2-PGIS介导的下游生物学作用的影响，明确SIRT1是否通过MR、VDR参与肾脏炎症和纤维化的调控。5. 肾纤维化的细胞内信号分子及基因调控利用转基因、基因敲除等技术系统，探讨Wnt/ P -catenin信号通路在肾纤维化中的作用及其机制，利用化学文库筛选并鉴定特异性抑制Wnt/ P -catenin信号的小分子抑制物，为研发干预肾纤维化的新药提供依据；寻找并鉴定参与调

5、控肾纤维化 的、Smad3依赖的miRNAs并阐明其作用机制，探索针对关键调节基因干预肾纤维 化的新途径。6. 预警或评估肾纤维化的生物标志物或靶标在既往对慢性肾脏病病理生理和DNA芯片研究的基础上，结合上述研究发现的生物标志物或关键靶标，改进 PCR芯片构建技术，确立最优化的检测方法；构建 基于肾纤维化病理生理机制的靶向基因芯片；通过比较分析不同分期慢性肾脏病患 者及健康人尿液mRNA，确立进展性肾脏病的生物标志物。应用靶向泛素化降解蛋白质技术构建与Smad3特异结合的Protacs,探讨其防治 肾纤维化的作用。二、预期目标（一）总体目标发现中国人群与进展性肾脏病相关的易感基因及表观遗传因素

6、；揭示免疫性和 代谢性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其分子机制；确定肾脏内分 泌激素对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控作用及其机制；阐明肾纤维化的细胞内关 键信号分子及基因调控；筛选预警或评估肾纤维化的生物标志物。获得一批原创性 成果；找到新的防止慢性肾脏病进展的干预途径；在肾脏病研究领域，培养一批临 床和基础紧密结合、适应一转化性研究11的新型复合型人才。（二）五年预期目标1. 完成IgA肾病的GWAS分析；阐明肾小球足细胞骨架蛋白基因突变 /多态性及其他基因突变与各种慢性肾脏病进展的关联和易感位点的致病作用；发现中国人与进 展性肾脏病相关的新易感基因；揭示天然免疫补体系统和获得性免

7、疫淋巴细胞激活 分子的遗传变异与免疫性肾脏病进展的关联；阐明Heys血症对基因组甲基化的影响及其在慢性肾脏病进展中的作用，为中国人慢性肾脏病进展和肾纤维化的预警和风险评估提供理论依据。2. 发现与我国常见慢性肾脏病发生发展相关的主要免疫学因素；明确肾脏免疫炎症过程中补体系统活化的关键途径及其沉积机制；揭示补体调节蛋白异常对补体系统 功能的影响和导致免疫性炎症的机制；找到主要致病自身抗体的关键抗原决定簇和与抗原决定簇扩散有关的同源性蛋白或病原微生物，为干预免疫性炎症、防止慢性 肾脏病进展和肾纤维化提供理论依据。3. 深入认识代谢性炎症在中国人慢性肾脏病发生发展中的作用。揭示炎症对肾固有细胞胆固醇

8、重分布、肾脏泡沫细胞形成和组织损伤的机制；阐明蛋白质氧化损伤导致肾脏炎症和纤维化的机制；明确叶酸缺乏和Heys血症在中国人慢性肾脏病进展中 的作用及其机制。为干预代谢性炎症、防止慢性肾脏疾病进展和肾纤维化提供理论 依据。4. 阐明髓样细胞MR在肾脏纤维化中的作用及其机制；明确活性维生素D对足细胞 功能及中间丝蛋白Nestin表达的调控及其机制；揭示C0X2-PGIS- PGI2通路在肾间 质纤维化中的作用；明确 SIRT1是否通过MR、VDR参与肾纤维化。阐明肾脏神经 激素对损伤修复和肾纤维化的调控及其机制。Wnt/ P -cateninWnt/ p -catenin5. 阐明进展性肾脏病的共

9、同致病途径一肾纤维化的分子机制。探讨信号通路在肾纤维化中的作用及其分子基础，筛选并鉴定特异性抑制 信号的小分子抑制物，为研发干预肾纤维化的新药提供依据；寻找并鉴定参与调控 肾纤维化的、Smad3依赖的miRNAs并阐明其作用机制，为干预进行性肾纤维化提 供理论依据。6. 根据肾纤维化机制和病理生理研究的发现，构建靶向性基因微阵列，通过高通量 分析尿液中mRNA，发现新的生物标志物，为最终实现无创、动态监测肾纤维化进 程奠定基础。7. 在国际学术期刊发表论文 60篇以上，并在本领域排名第一和第二的学术期刊发 表高水平论文若干篇；申请国内外发明专利若干项；开发相关的试剂盒，用于进展 性肾脏病的早期

10、诊断和防治。8. 为国家制定慢性肾脏病防治的卫生决策提供科学依据。9. 建立一支临床和基础紧密结合、多学科交叉的肾脏病研究队伍；推进临床和基础 研究成果的双向转化。三、研究方案（一）总体学术思路慢性肾脏病进展所致的 ESR是危害人类健康、消耗大量卫生资源的重大慢性病。慢性肾 脏病进展及其进展速度既与遗传基因（内因）有关，又与环境和营养等促进因素（外因）相 关，肾脏病变进展至 ESRI与个体对肾脏损伤的修复反应（内因+外因）密切相关。中国人遗传背景和环境因素都与国外人群存在差异，慢性肾脏病的原发疾病谱也与西方国家明显不同。免疫和代谢性炎症是中国人进展性慢性肾脏病的主要始动和促进因素，由此而导致的

11、肾脏疤痕化重塑 （纤维化）是各种慢性肾脏病进展至 ESRD的共同致病途径。因此, 本项目的总体学术思路是： 针对中国人特点和常见慢性肾脏病，利用大样本社区随访和慢性肾脏病人群样本及临床资源，揭示中国人慢性肾脏病向ESRD进展的主要遗传易感和促进因素及其交互作用；以肾纤维化为主线，通过模式动物、细胞分子生物学、基因组学、蛋白质 组学、肾脏病理生理学等研究手段，揭示肾脏损伤修复和肾纤维化的调控机制，明确肾脏进行性纤维化的细胞内信号分子和基因调控；发现预警或评估慢性肾脏病进展和肾纤维化风险为防治慢性肾脏病和制定的新生物标志物，找到防止或延缓慢性肾脏病进展的新干预靶标， 相关卫生决策提供科学依据。（二

12、）主要技术路线1. 遗传因素在慢性肾脏病进展中的作用及其机制一期研究采用 lllumina s n=1,500 ）进行全基因组 SNP1） 对中国人最常见的慢性肾脏病进行全基因组SNP佥测以中国人最常见的原发性肾小球疾病-IgA肾病为研究对象。Human610芯片对IgA肾病患者（n=1,500 ）和正常对照人群（检测，找出差异表达的SNP位点；二期验证选取前200个差异表达的SNPs位点，在另一患者群中（患者群 n=2,000 ;对照人群n=2,000 ）采用Sequenom s iPLEX assay 进行基因分 型，验证差异表达 SNP位点；结合患者的临床资料和实验室检查数据，观察差异表

13、达的SNP与临床表型及临床结局的关联性。按上述方法对中国人常见的其他慢性肾脏病进行全基因组SNP检测。采用PCR扩增外显子-直接测序法进行TaqMan探针法分析新发现的足细胞2）针对肾脏关键结构损伤的遗传关联分析利用已有的激素耐药的肾病综合症及其家系样本， ACTN 4基因检测，分析基因突变与表型的相关性；采用骨架蛋白（transgelin 、Arp2、Survivin 、Cytokaratin7 和 Vinculin ）编码基因的多态性 及其与肾脏病理、肾脏病变进展相关性；构建基因变异体，观察骨架蛋白基因变异对足细胞形态和功能的影响；并进一步观察骨架蛋白分子参与肾损伤的分子通路和干预的可能靶

14、点。研究编码PKD1/2基因突变在遗传性多囊肾发病学中的作用。3）针对肾脏病关键致病途径的遗传关联分析以中国人最常见的原发或继发性慢性肾脏病为重点研究对象。例如:IgA肾病（n=2, 000）、系统性红斑狼疮（n=1,000 ）、抗肾小球基底膜病（n=100）、ANCA相关性小血管炎（n=200）, 以正常人群（n=2,000 ）为对照；参考 HapMap和 GWA数据，以补体系统和淋巴细胞异常激 活作为候选致病途径；采用TaqMan探针法进行SNP基因分型，采用Real-time PCR, Paralog Ratio Test进行基因拷贝数定量；利用前期开发的相关数学模型，进行基因-基因交互

15、分析；相应阳性结论通过病例内表型关联分析和独立人群验证；确证的遗传学结果进一步进行相应的功能验证和相关机制探讨。DNA甲基化的影响及其与慢性肾脏病进展的 提取组织基DNA进行富集，运用lllumi na 深度测序法检测上述 发现具有显著变化的甲基化位点及其调控基因；观DNA甲基化水平及调控基因表达的影响；4）营养因素影响肾脏病进展和肾纤维化的表观遗传学机制 重点研究叶酸缺乏所致同型半胱氨酸血症对利用已建立关系。给予正常或慢性肾脏病模型动物富含蛋氨酸饮食诱导同型半胱氨酸血症， 因组DNA采用MedIP的方法对甲基化 组织内DNA甲基化并与正常组织相比较， 察补充叶酸对肾脏病变发展的影响和对 的慢

16、性肾脏病患者肾组织和血标本库，验证上述结果，并分析其与肾脏病进展的相关性。2. 免疫性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制1）补体系统活化在肾脏免疫性炎症中的作用本课题以ANCA相关性肾炎、抗GBM病和狼疮性肾炎为切入点，研究与肾脏病进展相关的 补体活化途径、补体调节蛋白变化及其对补体系统功能的影响。利用免疫组化和/或免疫荧光技术对抗 GBM病患者肾组织中沉积的补体分子进行检测。利用激光共聚焦技术，观察补体分子C4d, MBL的共定位以及Ficolin 和C4d的共定位；分析补体激活的途径及其与抗 GBMW临床病理表现的关系。检测狼疮性肾炎患者血清 CFH和C4BP水平；分析血清C

17、FH和C4BP水平与狼疮性肾炎病 情活动、病理类型和肾脏预后的关系。应用ELISA法检测抗mCR自身抗体对 mCRP与其结合力的影响和抗 C1q自身抗体对C1q 与其结合力的影响； 应用表面等离子共振技术（SPR进一步检测抗 mCRP和抗C1q自身抗体对C1q与CRP C4BP和CFH因子之间相互结合能力的影响。以mCRP和 C1q作为调理分子，应用双标记流式细胞仪检测抗mCRP和抗C1q自身抗体对吞噬细胞清除凋亡细胞的影响。2）自身抗体识别的靶抗原及其在肾脏病进展和肾纤维化中的作用机体产生针对肾脏某种成分的自身抗体及其与组织靶抗原的相互作用是形成免疫复合 物、启动免疫性炎症的关键环节。本课题

18、以ANCA相关性肾炎和抗 GBM病为切入点，应用蛋白质重组和短肽合成技术，采用抗GBMW患者的血清筛选抗 MPO抗体和抗GBMI身抗体的初 始线性抗原决定簇，并利用蛋白质分子信息学技术、根据分子模拟理论寻找同源性蛋白质及 可能的致病微生物。3. 代谢性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制1）胆固醇代谢紊乱促进慢性肾脏病进展和肾纤维化的分子机制本课题拟在细胞模型、模式动物和人群水平全面探讨SCA P-SREB Ps-LDL途径对胆固醇代谢稳态的影响及其在肾脏泡沫细胞形成中的作用，从全新的角度诠释脂代谢紊乱和代谢性炎症介导肾损伤的分子机制。包括：利用肾脏系膜细胞和肾小管细胞系，通过RN

19、Ai和基因转染技术，建立 SCAP基因沉默或过表达模型，在细胞水平明确炎症应激时肾脏固有细胞内SCA P的移位；利用生化法观察在炎症因子刺激下肾细胞内胆固醇分布和转运的变化；用荧光双标记法观察SCAP在肾细胞内从内质网向高尔基体的动态转移；分离内质网和线粒体，检测细胞器内SCA P的含量；通过检测高尔基体酶的活性及胰蛋白酶裂解等实验，探讨炎症对SCAP蛋白质翻译，翻译后修饰（糖基化）及分子构像的影响，并分析其与细胞内脂质聚集的关系。建立SCAP肾脏特异基因敲除和 SCAP基因过表达小鼠，在普通和高脂肪两种饮食下，通 过皮下注射10%酪蛋白或鼠疱疹病毒-68的方法，建立全身性低度慢性炎症模型，利

20、用氢质子磁共振波谱，在整体水平研究炎症应激对肾细胞摄取胆固醇和SCAP作用的影响以及 SCAP与肾脏脂质聚集、形态学改变、内质网应激、氧化应激及细胞凋亡的关系。利用各种慢性肾脏病血清和肾活检样本，探讨SCAP表达及细胞内定位与肾脏疾病表型的相关性。2）蛋白质代谢紊乱促进慢性肾脏病进展和肾纤维化的作用及机制采用前期研究中已建立的方法体外制备次氯酸修饰的同种白蛋白氧化产物（AOPP或晚期氧化糖化终产物（AGE修饰的白蛋白和脂蛋白，在体外与足细胞和肾小管上皮细胞株共 同培养，运用 western blot 、real time PCR 、免疫荧光等方法在体外观察蛋白质氧化损伤 对足细胞和肾小管上皮细

21、胞EMT细胞外基质积聚、细胞表达生长因子和促炎症因子的影响及其作用的受体和信号机制；给正常或慢性肾脏病大鼠模型慢性AOPP或 AGE负荷，在整体水平观察上述氧化损伤蛋白对肾细胞EMT肾组织表达炎症因子和细胞外基质积聚的影响。3）氨基酸代谢紊乱促进慢性肾脏病进展和肾纤维化的作用及机制在已建立的长期随访（随访时间超过5年）社区人群样本（n=50,000）中，分析叶酸缺乏、Hcys血症、和 MTHFR基因型与肾功能减退（eGFR下降）的相关关系；在已建立的大样本（n=20,000 ）社区高血压人群中，通过随机对照研究，比较补充叶酸加ACE抑制剂和单纯ACE抑制剂治疗对肾损伤进展和肾功能的影响；以明确

22、叶酸缺乏和蛋氨酸代谢紊乱在慢性肾脏疾病进展中的作用。采用分子生物学、细胞生物学等技术，检测高水平Heys对肾脏足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞、成纤维细胞等增殖、凋亡、活化、EMT等的影响，以阐明 Heys血症加速慢性肾脏疾病进展的机制。4. 肾脏内分泌激素对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控作用和机制1）醛固酮/ MR对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控作用采用髓样细胞M基因敲除（MRKO和野生型小鼠制备肾间质纤维化（UUO或糖尿病肾病（STZ模型。观察MRK对纤维化指标和肾功能的影响；分离单核细胞，观察MRK对其迁移力的影响；分析循环中促使单核细胞迁移的相关因子（Angn、MCP-等）变化；利用流式细

23、胞仪分析肾脏巨噬细胞亚群，探讨MRK对巨噬细胞亚群形成的影响；用CHiP法分析MR!否对单核细胞迁移和巨噬细胞极化相关基因有直接调控作用；比较MRKO、鼠和WTJ、鼠巨噬细胞SIRT1表达水平，通过CHiP分析 M调控基因与SIRT1的关系；采用SIRT1抑制剂，评价抑制SIRT1 是否通过髓样细胞M导致肾纤维化。2）维生素D/VDR寸肾脏损伤修复和肾纤维化的调控作用构建病毒载体上调或下调 Nest in和VDF基因并用嘌呤霉素（PAN诱导足细胞损伤，观察 足细胞形态、Nest in及细胞骨架蛋白acti n/tublin等表达和分布、以及Nephrin等裂隙膜蛋PANa、白的改变；用VDRi

24、因敲除（VDR-KO小鼠制备PAN莫型，分为野生型组、野生型加野生型加PAr和 VitD治疗组、VDR-KOa、VDR-KO加PAN组及VDR-KO加PAt和 VitD治疗组，观察 活性维生素DM PAN莫型动物足细胞Nest in表达及肾小球纤维化的影响；克隆野生型Nestin以及VDR吉合位点突变的启动子，通过检测luciferase 的活性分析Nestin基因转录情况。明确活性维生素D是否通过VDR-VDR直接调控Nestin基因表达。3）前列腺素对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控作用将已构建的Floxed COX2、Floxed PGIS转基因小鼠与与间质细胞特异性Cre （ FSP 1C

25、re,TNCCre）转基因小鼠交配，建立条件性肾间质细胞 COX2和 PGIS基因敲除小鼠。观察在正常 及疾病情况（UUO糖尿病肾病、5/6NX）下野生型和肾间质细胞COX2或 PGIS基因缺失小鼠肾脏形态、功能、细胞外基质产生及肾间质纤维化的变化，观察炎症反应、氧化应激、纤维 化相关信号通路等变化。5. 肾纤维化细胞内信号分子和调控机制研究1）Smad3调控的miRNAs及其在肾纤维化中的作用利用慢性肾脏病患者肾组织活检标本，用免疫组化法检测 TGF- /Smads信号通路激活和组织纤维化指标，用原位杂交法检测miR-21和miR-29表达。分析 miR-21和miR-29表达与TGF- /

26、Smads信号通路活化程度、肾纤维化及肾功能损伤程度的相关性。采用Smad3基因敲除、野生型成纤维细胞、稳定的敲低smad3肾小管上皮细胞、Dox-诱导的Smad7过表达的肾小管上皮细胞，在有/无Angn受体阻断剂或TGF-.中和抗体的情况下，Smad3用TGF-.1和Angn刺激上述细胞株，应用miRNAmicroarray 和real-time PCR寻找调控的致纤维化性miRNAs利用Smad3基因敲除和野生型小鼠，分别构建慢性肾脏病EMT（5/6NX ）、抗GBM病和马蔸苓酸性肾病模型，在整体水平观察miR-29表达、肾细胞肾纤维化及肾功能的变化。miRNA克隆TGF-./Smad3依

27、赖性野生型 miRNAs （如miR-29 ）以及Smad3结合位点突变的 启动子，分别将其转染至Smad3敲除或野生型系膜细胞、成纤维细胞和肾小管上皮细胞；用荧光活性报告基因检测启动子活性；通过染色体免疫共沉淀（ChiP法）和ChiP-Seg法证实Smad3通过Smad结合位点与与致纤维化性miRNAs启动子直接结合。将Pre-miR-29 （诱导 miR-29过表达）或anti-miR-29 （抑制 miR-29表达）转染Smad3敲 除或野生型成纤维细胞和肾小管上皮细胞；观察在TGF-.1和Angn刺激下，上述细胞产生细胞外基质的变化；采用超声微泡基因转入技术将Pre-miR-29或an

28、ti-miR-29 转入肾脏，之后分别建立5/6NX、抗GBM病和马蔸苓酸性肾病模型，在整体水平观察miR-29表达及其对肾纤维化进展的影响。2）Beta-catenin 信号在肾纤维化中的作用在整体水平研究过表达Wnt1/4对肾纤维化的影响。通过尾静脉快速注射法将 pcDNA-Wnt1/4导入体内（前期研究已经证明其中大部分将通过循环到达肾脏），之后构建肾间质纤维化模型（UUO、局灶节段硬化性肾炎模型（阿霉素模型）和急性肾损伤转至慢性肾 脏病的模型（慢性叶酸负荷模型），检测3 -catenin 下游靶基因snail、MMP-7 PAI-1、Fsp-1 的表达；观察细胞外基质表达的变化、肾纤维

29、化程度和肾功能的变化。在细胞水平研究过表达 Wnt1/4对细胞外基质分泌的影响。（1）采用稳定表达 Wnt1/4的HKC细胞系，或在培养基中加入 Wnt刺激内源性3 -catenin 表达，或用siRNA降低内源性3 -catenin 表达；而后观察3 -catenin 下游靶基因的表达；观察细胞外基质的表达和EMT相关指标变化。（2）用Affymetrix基因芯片寻找新的3 -catenin 下游靶基因，并用荧光活性报告基因检测3 -catenin 对靶基因启动子活性的调控；通过ChiP法证实3 -catenin 与其靶基因启动子的直接相互作用。在整体水平研究3 -catenin 信号通路对

30、肾纤维化及肾功能的影响。分别构建近端肾小 管、远端肾小管/集合管特异的3 -catenin基因敲除小鼠，构建曼性叶酸肾病模型，观察3-catenin 基因敲除对肾脏纤维化程度和肾功能的影响；尾静脉注射3 -catenin信号通路的小分子抑制剂ICG-001，观察抑制3 -catenin 对UUO阿霉素模型和慢性叶酸负荷模型肾纤 维化和肾功能的影响。6. 预警/干预进展性肾脏病和肾纤维化的生物标志物 /靶标1 ）从尿液中筛选早期识别和动态评估肾纤维化的生物标志物构建基于固相PCR反应的DNA芯片和多重PCR产物检测的DNA芯片。提取患者和对照组 的尿液沉渣细胞 RNA并逆转录合成cDNA分别进行

31、固相 PCR或液相多重PCR反应。将上述 两种芯片检测结果与real time PCR结果进行比较，评价两种芯片的可靠性、可重复性和敏 感性。建立完整的数据处理系统（包括数据预处理、基因表达差异分析、确定最优化的生物标志物、评价目的标志物的真/假阳性率、构建受试者特征曲线ROC、和评价动态变化的生物标志物对疾病发展的监测作用等）。根据既往对肾纤维化机制的理解和本项目发现的纤维DNA芯片，检测患者和正常人尿0.5的标志物，通过回顾性纵向化相关分子，选取与早期病理生理改变密切相关的因子构建 液mRNA找到有表达差异的指标。对ROC曲线下面积大于研究和前瞻性队列研究作进一步临床验证。2）干预肾纤维化

32、的新生物靶标CHIP的抗肾纤维化作用。CHIP的基础表达；采用FLAG标用分子生物学技术在体外研究系膜细胞和肾成纤维细胞记的PCDNA3-CHIP质粒转染细胞上调 CHIP表达或利用 RNA干扰技术下调 CHIP表达，观察其 对TGF-3 1诱导的纤维化相关分子表达的影响；将CHIP上调/下调的细胞与蛋白酶体抑制剂MG132共同作用，观察对 Smad3 p-Smad3和p-Smad2表达的影响。在动物模型上采用超声 微泡法转染FLAG标记的PCDNA3-CHIP质粒，研究上调肾脏 CHIP表达对UUC和糖尿病肾病 肾脏病理、细胞外基质积聚和肾功能的影响。根据Smad3和CHIP的分子结构，设计

33、和构建Protacs ;通过体外细胞模型，验证Protacs对系膜细胞和成纤维细胞Smad3下游靶基因的抑制作用；通过体内研究进一步验证Protacs对UUC和糖尿病肾病模型的肾脏保护作用。HSP 72调控肾脏炎症反应的作用和机制。分别采用HSP72单基因、双基因敲除和野生型小鼠建立UUO莫型；设立假手术组、UUOa和UUC加GGA灌胃组；观察HSP72对炎细胞浸润和炎症因子表达、细胞外基质沉积、 成纤维细胞标志蛋白（a -SMA和FSP-1）表达和肾间质纤 维化的影响以及对肾组织 Stat3信号通路的作用。在体外细胞模型观察上调/沉默细胞HSP72 对Angn刺激下肾细胞炎症因子释放及Sta

34、t3转录活性的影响。修正版6.四、年度计划研究内容预期目标1.2.3.4.5.建立研究所需的各种细胞模型、动物 模型，繁殖转基因、基因敲除小鼠； 收集研究所需的临床样本。分析IgA肾病、家族性肾病综合征家 系和特发性肾病综合征患者足细胞骨 架蛋白的基因突变；针对补体系统、 淋巴细胞异常活化途径以及自噬通路 的相关基因，进行候选基因遗传变异 与IgA肾病和狼疮性肾炎发病易感性 的遗传关联分析。完成IgAN患者的全基因组SNP检测； 以及肾脏病患者DNA甲基化位点的检 测。筛选并确定抗 MPC抗体和抗GBM自身 抗体的初始线性抗原决定簇，研究抗 原决定簇与疾病时相以及临床表型关 系。体外观察活性维

35、生素 D对PAN诱导足 细胞损伤及巢蛋白表达的影响； 完成基于固相PCR反应的DNA芯片以 及多重PCF产物检测DNA芯片的构建。1.2.3.4.5.6.建立各种细胞模型，以及成熟的细胞 分子生物学技术，为下步实验提供实 验材料和技术平台。初步确定抗 抗原决定簇， 的作用。初步发现在GBM自身抗体的初始线性并证实其在抗GBM病中IgA肾病中差异表达的DNASNP位点，以及肾脏病患者的低 甲基化位点。通过体外细胞研究证明维生素D可治疗PAN引起足细胞损伤。解决基因芯片构建关键技术的优化， 为临床标本检测构建可靠的技术平 台。发表SCI论文5-10篇。修正版5.7.研究内容预期目标1.2.3.4.

36、5.6.7.1.2.3.4.6.对差异表达的SNP和 DNA低甲基化位 点进行大样本验证；分析它们与临床 表型、病理类型及预后的关系。针对所发现的遗传基因变异，进行SNP基因分型，基因拷贝数定量；及 其与疾病发病、表型的相关分析。检测ANCAri关性肾炎患者C5a受体的 表达，研究C5a激活的中性粒细胞发 生呼吸爆发的信号转导途径。观察炎症对 SCAP在细胞器内以及细 胞内胆固醇分布的影响。在体外观察氧化修饰蛋白质和同型半 胱氨酸对肾脏固有细胞的损伤作用。 探讨髓样细胞 MR的致肾脏纤维化作 用，以及活性维生素 D对肾小球硬化 的影响。寻找受Smad3调控的新miRNAs研究 Wnt1、Wnt

37、4和CHIP对肾小管上 皮细胞EMT 3 -catenin 下游靶基因 snail、MMP-7 PAI-1、Fsp-1 表达的 影响。研究足细胞骨架蛋白分子在慢性肾脏 病进展中的作用。利用动物模型，在整体水平研究C5a受体在ANCA相关性肾炎发病中的作 用。探讨介导氧化修饰蛋白和同型半胱氨酸引起细胞损伤的信号机制。研究髓样细胞 MR在糖尿病肾病中的 作用；利用 VDR基因缺陷小鼠，验证 维生素D通过VDR影响足细胞。研究Smad3对miRNAs的调控机制。通过临床病例筛查进一步优化用于基因芯片的mRNA勺类别及数目。研究上调 CHIP蛋白表达对肾脏结构 和功能的影响。明确与IgAN发病密切相关的 SNP位 点，明确DNA低甲基化与慢性肾脏病 发病的关系。明确参与IgA肾病和狼疮性肾炎发病 易感性的固有免疫成分补体系统和适 应性免疫异常淋巴细胞激活的相关分 子，阐明自噬通路相关基因参与自身 免疫性疾病肾脏损害的机制。确定足细胞骨架蛋白分子异常的致病 机制。证实MR参与肾脏纤维化；证实 miR-21 和 miR-29 是 TGF/Smad3 下游的肾脏纤维化的特异性靶基因， 发 现新的Smad3特异性靶基因。6. 阐明Wnt1和 Wnt4在肾纤维化、肾小 管上皮细胞EMT中的作用。7. 发表SCI论文5