柱前衍生化 - 高效液相色谱法跟踪检测酶法制备 - D - 谷氨酰 - L - 色氨酸反应过程-

1、柱前衍生化2高效液相色谱法跟踪检测酶法制备C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸反应过程屠春燕*吴燕娇 袁艳娟 姚忠 唐美华 韦萍(南京工业大学生物与制药工程学院,南京210009摘 要 C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸(SCV 207是一种新型广谱免疫调节类化合物。针对酶法合成SCV 207反应体系的特点,以邻硝基苯磺酰氯为柱前衍生试剂,RP 2HPLC 为分离模式,选用L i chrosphe r C 18柱,20mmol/L 磷酸盐溶液(p H 3.0和乙腈为流动相,梯度洗脱,检测波长230n m,建立了同时分析测定多种氨基酸和小肽的方法,所有组分于15m i n 内洗脱完毕。氨基酸及二肽在0

2、.96260L m ol/L 范围内线性良好,相关系数大于019991;加标回收率在97.8%101.6%之间;相对标准偏差为1.2%2.9%。本方法适用于SCV 207产品的纯度分析,以及酶法转肽制备SCV 207反应过程跟踪检测,具有分析速度快,准确度高、操作简单等优点。关键词 色氨酸,邻硝基苯磺酰氯,衍生化,反相高效液相色谱 200202219收稿;2009205213接受*E 2m ai:l tcy7341126.co m 1 引 言C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸(C 2D 2G l u ta myl 2L 2tryptophan ,S CV 207是一种新型广谱免疫调节类化合物,作

3、用类似胸腺素A 1,在老鼠体内进行的实验已证实了它对抗肺结核病的生物活性1。Suz uk i 等2在2004年最早建立了酶法合成SC V 207技术,近年来国内也有相关的报道3,4。该方法是利用C 2谷氨酰转肽酶07为谷氨酰供体,并生成相应的氨基酸,且这一水解过程是不可逆的2,3,这导致转肽反应过程中目的产物SC V 207转化率降低,同时也使酶法制备SCV 207的反应体系复杂化。因此建立快速、可行的分析方法监控反应进程以获得高收率、高纯度的谷色二肽极为重要。柱前衍生高效液相色谱法是小肽或氨基酸分析的主要方法,方法的关键在于衍生剂的选择。目前,常用的衍生剂主要有邻苯二甲醛6、氯甲酸芴甲酯8、

4、丹酰氯9及二硝基氟苯10等,这些方法均存在一定的缺陷11,且所建立的方法大多侧重于分析产品,用于同时监测酶反应体系中的氨基酸和小肽的方法尚未见报道。本研究采用邻硝基苯磺酰氯为柱前衍生试剂,以酶法制备SCV 207的反应体系为分析对象,建立一种用于跟踪检测反应过程的分析方法,以求推广到其它同类反应过程的检测分析。2 实验部分2.1 仪器与试剂Beckman 126/166型高效液相色谱仪(美国Beckman 2Coulter 公司。邻硝基苯磺酰氯(江苏中意化工技术开发研究所提供;C 2GT(南京工业大学材料化学工程国家重点实验室提供;S CV 207(南京工业大学生物与制药工程学院小肽合成室自制

5、,纯度>99.9%;D 2谷氨酰胺(D 2G luta m ine ,D 2G ln、L 2色氨酸(L 2T r yptophan ,L 2Trp、L 2谷氨酸(L 2gl u ta m ic ac i d ,L 2G l u ,上海国药集团;乙腈(色谱纯,M er ker 公司;其它试剂均为国产分析纯。2 实验方法准确称取各标准品,用0.1mol/L HC l 溶解,配制成储备液(D 2G ln 及L 2G l u 的浓度约为3mmol/L ,SC V 207及L 2Trp 的浓度约为1mmol/L。移取50L L 混合储备液置于2mL 的具塞磨口试管内,依次加入硼酸缓冲液(0.05m

6、mol/L ,p H 9.01mL ,邻硝基苯磺酰氯的乙醇溶液第37卷2009年10月 分析化学(FENXI HUAX UE 研究简报Ch i nese Journa l of Ana l yti ca l Chem istry 第10期15281530(40mmol/L80L L ,混匀,塞紧后于30e 水浴中衍生反应30m i n 后,以8000r/m i n 离心10m i n ,待用。3.0,流动相B 为乙腈;洗脱梯度:25%B 0y 13m in 95%B ;流速:1mL /m in ;进样量:20L L ;检测波长选择在二肽及氨基酸衍生产物的最大吸收230n m 处;室温。3 结果

7、与讨论3.1 缓冲盐种类及p H 值的选择实验对醋酸缓冲盐2乙腈体系、磷酸缓冲盐2乙腈体系进行考察,最后确定以磷酸缓冲盐2乙腈作为流动相。其中缓冲盐的p H 对分离的影响较大,pH U 5时,谷氨酸保留较短,与衍生试剂水解产物分离度不佳;当缓冲盐pH U 3.0 时,谷氨酸保留时间增大且各组分均达到基线分离(图1。图1 标准品(a和酶反应液(b色谱图F ig .1 Chro m ato gra m of standard sa m ple(aand reacti on sol u tion(b1.G l uta m i ne(G l n ;2.G l u ta m ic aci d(G l u

8、;3.C 2D 2G l uta m yl 2L 2tryp t ophan(SC V 207;4.L 2Tryptophan(T rp.3.2 衍生方法重复性考察将混合样品衍生反应液在室温下保存2d 后测定。结果显示,各衍生产物的峰形、峰面积、保留时间等无明显差异,各组分衍生产物测定结果的RSD 均<2%,表明此衍生产物具有良好的稳定性。3.3 标准曲线、准确度、精密度及检出限Table 1 Li near regressio n equati on ,corre l a ti on coe fficient ,de tecti on li m it ,recovery and pre

9、c i sio n成分Compon ent线性范围L i n ear range (L m ol/L回归方程Regress i on equati on 相关系数Correlati on coeffici en t 检出限Detection li m it (f m ol/L平均回收率A verage recovery (%RS D (%,n =6谷氨酰胺Gln在已知成分的酶反应液中分别加入高、中、低3种不同浓度的氨基酸及二肽标准混合液,混匀,衍生化后进样分析,考察分析方法的回收率和相对标准偏差(表1。结果表明,回收率在97.8%101.6%范围内,相对标准偏差为1.2%2.9%。3.5 酶法

10、制备SCV 207的反应过程分析称取适量L 2Trp 和D 2G l n 溶于p H 10.0的缓冲液,混匀;加入适量酶液,40e 下反应3,按一定时间1529第10期屠春燕等:柱前衍生化2高效液相色谱法跟踪检测酶法制备C 2D 2谷氨酰2L 2色氨酸反应过程1530分析化学第37卷从图2可以看出,随着反应的进行,底物产物L2Trp和D2G ln浓度下降,产物SC V207与G l u的浓度逐渐升高,结果表明:C2GT不仅通过其转肽活性生成了二肽,同时在反应过程中存在C2GT对产物SCV207的水解作用,这为深入了解此类反应的作用机理,有效控制反应进程提供了有益的借鉴。图2酶法合成SC V20

11、7的进程曲线F i g.2Co nversi on process of SCV207by enzy m atic sy n2thesis procedureR efer ences1A lexander A K,Andrey S S,Sergey V K.USP,5744452,19992Suzuk iH,K ato K,Ku m aga iH.Journa l o f B iotechnology,2004,111(3:2912953W ang Q ian(汪前,Yao Zhong(姚忠,Xun Zh i2Ji n(荀志金,Xu X i ao2Y i ng(徐晓滢,Xu H ong(徐虹,

12、W e i P i ng (韦萍.J o urna l of Che m ica l Eng i neering o f Ch i nes e Un i versities(高校化学工程学报,2008,22(2:2882934W ang Q ian(汪前,Yao Zhong(姚忠,W uM i ng2Gang(吴明刚,Xun Zhi2J i n(荀志金,Zhou Zh i(周治,Xu H ong (徐虹,W e i P i ng(韦萍.J o urna l of Che m ica l Indu stry a nd Engineering(化工学报,2008,59(2:4314365Ke il

13、l or JW,Castonguay R,Lherbet C,H el m ut S,Lester P.M etho ds i n Enzy m olo gy,2005,401:4494678Qu Q S,Tang X Q,W ang C Y,Yang G J,H u X Y,Lu X,L iY,L i S C,Yan C.Ana l.Ch i m.Acta,2006,572(2: 21221810Yu H o ng(于泓,M u Sh i2Feng(牟世芬.Chinese J.Ana l.Che m.(分析化学,2005,33(3:39840411Tu Chun2Yan(屠春燕,Zhao J

14、un(赵珺,Ge Jia2Lu(葛佳璐,W u Yan2Jiao(吴燕娇,TangM e i2H ua(唐美华,L i Shou2Chun(李寿椿.J o urna l o f Instru m enta l Ana l ysis(分析测试学报,2008,27(7:681685Ana lysis of C2D2G l u tam yl2L2tryp tophan i n Enzy m a tic Syn thesis P rocedure by H igh P erform ance L i qu i d Ch ro m atography TU Chun2Yan*,WU Y an2Jiao,

15、YUA N Y an2Juan,YAO Zhong,TANG M e i2Hua,WE I P i n (Institute o f B iotechnolo gy and P ha r m aceutica l Engineer i ng,N anjing Un i versit y o f Technolo gy,N anjing210009Abstr act C2D2G l u ta myl2L2tryptophan(S CV207is a pr ospecti v e med ici n e f or the treat m ent of tubercu l o2 sis.The RP

16、2H PLC method was used to analyz e the practica l syste m of S CV207by enzy matic synthesi s f ro m D2gl u ta m ine and L2tr yptophan.Under the opti m al conditi o ns,the chro matograph i c conditi o ns were as f oll o ws: L i c hrospher C18column(250mm4.6mm,5L mwas used,the detection wavelength was

17、230nm.F l o w rate was110mL/m in;mobile phase A was20mmol/L sodi u m dihydrogen phosphate(p H3.0,mobile phase B was AC N;t h e gradient pr otocolwas applied.A ll co mpounds were co mpletely eluted in15m i n.The linear re lati o n2 sh i p was obtained bet w een peak area and concentrati o n f or D2G ln,L2G l u,SC V207and L2Tr p with correlation coefficients h i g her than019991.The recoveries of t h e analyses f ro m sp i k i n g experi m ents were97.8%-10116%,w ith relative standard deviation