微柱凝胶免疫技术及其在临床输血中的应用(输血规程)

1、第 章 微柱凝胶免疫技术及其在临床输血中的应用1990年法国学者Y.lapierre发表文章介绍一种检测红细胞抗原抗体反应的新技术(new way to detect red cell antigen-antibody reaction)凝胶试验(Gel test),现称之为微柱凝胶免疫试验(Micro column gel immuno-accay,MGIA )。红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的免疫凝集反应。MGIA与试管（玻片、纸片）盐水介质血凝试验一样简便、准确，但却比试管血凝试验敏感性高，且易标准化。美国输血协会自输血技术手册第12版（1996年）起就已经将该技术列入

2、红细胞血型检测的常规技术中。而今，该新技术正在取代百年的传统血凝技术，应用在红细胞血型血清学临床常规检验工作中，MGIA解决了红细胞血型血清学临床检测工作中长期存在的两个问题，即对不完全抗体的检测和对混合血样本的检测。一、 MGIA的原理：1、 人红细胞抗原与相应抗体发生特异性免疫反应（其本质为血凝反应）。2、 检测系统是在微柱中（载体）将反应介质凝胶（sephdexG-100或50葡聚糖胶）或小玻璃装入微柱中。3、 凝胶或小玻璃珠的间隙具有分子筛作用。4、 凝集的红细胞（结合的）被留在微柱上面成带状或凝集颗粒散布凝胶中间。5、 未凝集的红细胞（即未结合、游离的）通过离心后沉入微柱的底部。二、

3、MGIA试剂分类：微柱凝胶实验试剂依其凝胶中有无抗体及抗体性质分为中性胶、特异性胶和抗人球蛋白胶。1、 中性胶 微柱腔及胶中不含特异性抗体，也不含抗人球蛋白。此胶用于检测IgM类抗体与红细胞抗原的反应。如ABO血型反定型。2、 特异性胶 微柱腔中及胶中含有特异性抗体，用于血型抗原检测。3、 抗人球蛋白胶 微柱腔及胶中含有抗人球蛋白，此胶是应用广泛的一种微柱凝胶卡。用于检测IgM类完全抗体及IgG类不完全抗体的检测。三、MGIA的临床应用：（一）ABO血型1、原理：根据红细胞表面有无A或B抗原将血型分为A、B、O、AB四种。（1）ABO、Rh(D)血型正定型试剂卡（该卡主要用于体检及新生儿血型鉴

4、定）原理：正定型用已知抗A和抗B血清试剂检测被检者红细胞中有无相应抗原。图一、ABO、Rh（D）血型正定试剂卡反定型：用已知A、B细胞（抗原）来检测被检者血清中有无相应抗体。（2）ABO、Rh(D)正反定型试剂卡。（该卡主要用于检测受检者与供血者血型鉴定与复查）。图二、ABO及Rh(D)正反定型试剂卡A、为什么要强调在ABO血型鉴定时一定要做正反定型？常规的ABO定型必须包括正定型（即用抗A、抗B作红细胞定型）和反定型（即用A、B细胞作血清定型）互相验证，使血型鉴定结果准确无误。仅做正定型可能存在的问题如标准血清效价偏低，室温放置过久，类B现象，红细胞多凝凝或全凝集。某些疾病原因抗原减弱，器官

5、移植患者红细胞上抗原不易检出，易被误定。但其血清中含有与血型相对的抗体，所以反正型可防止某些A、B亚型漏检。B、 ABO正反定型结果不一致的常见原因：（1）人为因素、试剂不标准、失效或污染。操作中加错样品或试剂离心速度不足或过度，或报结果时间仓促、细胞与血清比例不当，结果误判等。（2）客观原因：1，因某些疾病导致抗原减弱，红细胞发生多凝集现象及产生抗原；2，抗体含量低（如婴儿、老人、低丙球血症等）体内有不规则抗体、某些药物干扰等。C、 为什么出生3个月内的婴儿可不做反定型？出生3个月内的婴儿，其血清中所有能检出的抗体均来自母体，自身未产生抗体，当母婴血型不同时，ABO正反定型常不一致，所以出生

6、3个月内的婴儿ABO定型仅做正定型，即使6个月内的婴儿由于自生抗体较弱亦可不做反定型。（二）Rh（C、D、E、c、e）血型。原理：Rh血型系统主要有五种抗原即C、c、D、E、e抗原，在临床检测中一般只要求做D抗原鉴定，凡被检红细胞和抗D血清凝集为Rh(D)阳性，反之为Rh（D）阴性。A、 Rh抗原检测原则：对受血者一般只测Rh（D）抗原，而对供受者不仅要检查Rh（D）抗原，并在其为阴性之前提下，必须进一步确定是否为Rh弱D型。B、 Rh（D）抗原阴性受血者的输血原则：供受者双方ABO血型相同，还要求Rh（D）抗原阴性相同。C、 新生儿溶血病患儿输血或换血原则，ABO血型同患儿相同，Rh血型同母

7、亲相同。D、 Rh弱D型输血原则，Rh弱D型为供者应视为Rh（D）阳性使用。作为受者应输Rh（D）阴性血。E、 Rh弱D型妇女与Rh（D）阳性丈夫生育的婴儿可能会产生新生儿溶血病。F、 Rh弱D型受者血小板输注原则：尽管血小板表面无Rh抗原，但制剂中仍含有一定量的红细胞（可使受血者致敏）故Rh（D）阴性生育期妇女（含女童）应输Rh（D）阴性血小板。（三）不规则抗体筛查及鉴定：不规则抗体也称为不完全抗体额外抗体意外抗体等，是除ABO系统以外的抗体如Rh系，MN系，P系，Kidd系Duffy系等等的抗体，是引起交叉配血不合的重要原因，也是引起输血反应，新生儿溶血病的重要原因之一，目前不规则抗体筛查

8、已列为输血前常规检测，且广泛应用于输血反应诊断，预防母婴血型不配合所致新生儿溶血病诊断等方面。 鉴定方法是用一组筛选试剂细胞(筛选谱细胞)该组试剂细胞应包括大部分有临床意义的抗原。至少有以下常见的抗原：D、C、E、c、e、M、N、S、s、P、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb、Jka、Jkb、抗体筛查阳性则提示可能被检者体内存在有临床意义的不规则抗体，应再用一组鉴定试剂细胞（鉴定谱细胞）进一步鉴定抗体的特异性，以便事先选择缺乏与之相对应抗原的供者。1、不规则抗体（主要为IgG类抗体）反应的基本原理。由于红细胞表面含有唾液酸而带负电荷，互相之间因静电斥力保持一定的距离（大于24nm）1个Ig

9、G分子（跨度仅约14 nm）不能同时连接2个红细胞，因此不能直接造成红细胞的凝集。必须应用特定的方法使被IgG抗体致敏的红细胞发生凝集。这些特定方法及其原理分别是：（1） 酶介质（通常用木瓜酶菠萝酶）是通过降低红细胞表面的负电荷的原理，缩短细胞间的最小距离（其缺点是该技术的复杂性以及在制备试剂条件和判读结果时所需要的技巧）。（2） 胶体介质：如人血白蛋白，AB型人血清（该实验亦不用）。（3） Polybrene (聚凝胶)介质是利用Polybrene中和红细胞表面的负电荷的原理（缺点是该法可受患者体内冷凝集素及血浆蛋白的影响，灵敏度过度，易出现假阳性。（4）抗人球蛋白试验（Coombs）通过在

10、红细胞表面的致敏的IgG分子之间搭桥，形成凝集（Coombs）试验是最经典的最准确的不规则抗体检测方法。为理论上的金标准。但为什么发现至今半个多世纪末在临床常规应用。其主要原因是耗时长，需要反复洗涤红细胞。实验过程过于烦琐且需用阳性抗体致敏的红细胞做阳性对照，易出现假阴性，不利于普及和推广，特别是在急诊情况下易延误治疗。 而今，应用MGIA则完全克服以上方法之缺点，使理论上的金标准成为现实。2、试剂(1).抗人球蛋白微柱凝胶卡(MGIACoombs卡)(2).筛选谱细胞(一般为3组)(3).鉴定谱细胞(一般为11组)图四:不规则抗体筛检卡不规则抗体筛检用于不规则抗体筛检和鉴定 可以检出更多的临

11、床有意义抗体,保证临床输血安全,避免溶血性输血反应的发生。A、 不规则抗体筛检试验在临床输血中是很有价值的,但仍有其局限性,其原因有二,一是低频抗原的抗体可能被忽略,二是以往免疫的抗体已降到难以检出的水平.因此抗体筛检试验不可能检出有临床意义的全部抗体.B、 不规则抗体筛检.必须对有输血史,妊娠史或短期内需要接受多次输血者及交叉配血不合者进行筛检.C、 不规则抗体筛检的重要性,有利于早期发现和确认具有临床意义的抗体并可在配血前鉴定此抗体,以获得充足的时间来选择缺乏相应抗原的相配合的供者,以避免因寻找不到相合的血源而延误受血者的治疗.D、 不规则抗体筛查的技术要求1) 尽可能多的检测出有临床意义

12、的抗体。2）尽可能少的检测出无临床意义的抗体。3）尽可能快的完成抗体检测。（四）、 交叉配血试验 1.原理：交叉配血是指检测供血者的血液或血制品与受血者的血液在免疫血液方面“相溶性”避免受血者发生急性或迟发性溶血性输血反应，以确保受血者输血安全。交叉配血分“主侧”交叉配血，即受者血清与供者红细胞的相容试验，“次侧”交叉配血，即受者红细胞与供者血清的相容试验，交叉配血使用的检测方法必须是能检测IgM和IgG型抗体的方法。 2试剂：抗人球蛋白微柱凝胶（MGIA-Coombs）卡图五，抗人球蛋白交叉配血卡抗人球蛋白交叉配血用于交叉配血可同时检出IgM和IgG类抗体，保证临床输血安全，避免输血反应的发

13、生。（五）、抗人球蛋白(Coombs)试验1.原理:不完全抗体与相应红细胞在盐水介质中结合后不表现凝集反应,这种结合了不完全抗体的红细胞称为致敏红细胞,由于不完全抗体分子量小,分子距离短,不能克服红细胞彼此的排斥力.所以红细胞不能靠拢而显凝集,但人球蛋白本身又是很好的抗原,可用来免疫动物使之产生抗人球蛋白,将抗人球蛋白试剂加入已致敏红细胞盐水悬液中,由于人球蛋白与抗人球蛋白的特异性反应(俗称搭桥)可以与红细胞上的不完全抗体产生抗原抗体反应.而使红细胞显示肉眼可见凝集亦证实不完全抗体的存在。2. 试剂:抗人球蛋白微柱凝胶(MGIA-Coombs)卡本试验分直接和间接二种,(1).直接抗人球蛋白试

14、验(DAT),用于检查受检者红细胞上是否已结合了不完全抗体,主要为IgG和补体C3,在临床上应用于胎母血型不合的新生儿溶血病(HDN),免疫溶血性输血反应(LHTR),自身免疫溶血性贫血(AIHA),药物导致的免疫溶血性贫血等.(2).间接抗人球蛋白试验(IAT)红细胞在体外与不完全抗体结合后,在应用抗人球蛋白进行检测的试验(证实被检者体内存在游离不完全抗体),在临床上应用于红细胞血型定型,不完全抗体筛查及鉴定,抗体效价检测,红细胞放散试验中对抗体的检测和鉴定,相溶性配血试验等。Coombs卡（六）、新生儿溶血病（HDN）试验诊断新生儿溶血病是一种母婴血型不合而引起的免疫性溶血病，在我国常见为

15、ABO HDN，其次为Rh HDN，MN等血型系统引起的HDN也有报导，胎儿或新生儿的红细胞被来自母亲的IgG抗体所包被（致敏）并使胎儿或新生儿单核巨细胞系统内受到免疫性破坏。1.HDN发病机理，胎儿的血型基因一半来自母亲，另一半来自父亲，来自父亲的基因恰好是母亲所缺乏的，胎儿的细胞就有可能刺激母亲产生抗体，这种抗体的性质为免疫性抗体，并能通过胎盘，一旦这种抗体通过胎盘进入胎儿血液循环，就可能与胎儿红细胞结合并破坏红细胞而发生溶血现象。 2.临床症状：HDN有水肿，黄疸，流产，死胎，贫血和肝脾肿大，黄疸深者可能并发核黄疸，病情取决于母亲抗体量，抗体与细胞结合的程度，胎儿代偿性造血能力及免疫功能

16、状况等诸多因素。 3 .试剂：抗人球蛋白微柱凝胶卡（MGIA-Coombs）HDN试验操作程序 ABO系HDN与非ABO系（ABO系之外）HDN都须做三项试验：(1).直接抗人球蛋白试验。用于确定婴儿红细胞是否被母亲IgG抗体包被（致敏）ABO系HDN直接抗人球蛋白试验常常较弱或阴性，因此，直抗试验结果仅起参考作用，而ABO系以外的HDN直抗试验一般为阳性对临床诊断起决定性作用。(2).游离IgG抗体测定（间接Cooms试验）用间接抗人球蛋白试验检测婴儿血清中是否有游离的IgG抗体，在ABO系HDN中，A型新生儿血清中可有少量抗A和较多的抗B，B型新生儿血清中可有少量的抗B和较多的抗A。“O”

17、细胞是用来检测ABO系统以外的IgG抗体，总之，A型婴儿血清中检出抗A（IgG），B型婴儿血清中检出抗B（IgG）或检出ABO以外的IgG抗体，都是HDN的重要诊断依据。(3).放散试验。ABO系HDN用加热放散法，其它血型系统的HDN用乙醚放散法，A型患儿红细胞上放散出抗A，B型患儿红细胞上放散出抗B，或放散出ABO以外的抗体都是阳性指征。ABO系HDN(1).采集35ml新生儿和母亲抗凝血，分离血浆备用。(2).用N.S三洗红细胞，末次压积后吸净盐水。(3).取小量红细胞做ABO、Rh定型。(4).取MGIA-Coombs卡一张（8孔），加患儿35%红细胞悬液10 ul 至第一孔，立即离心

18、10分钟（直抗试验），（24孔）做游离试验，分别编A .B. O，（57孔）做放散试验，分别编AC、BC、OC，24孔各加患儿血浆（或母亲血浆）40ul，57孔加患儿放散液40ul（附患儿放散液提取法）。(用以上N.S三洗压积红细胞加等量或1/2量N.S，置56水浴10分钟,其间轻轻摇动二次,离心,上清即为放散液)。(5)分别在2、4孔加入10 ul 3-5%A红细胞悬液，3、6孔加入3-5%B红细胞悬液，5、7孔加入3-5%O红细胞悬液，8孔加入患儿血浆40ul, 3-5%患儿红细胞悬液10ul(做自身对照)。(6)37孵育15，离心10,观察并记录结果。 AB0系之外HDN(1) .标本采

19、集,制备压积三洗红细胞及其悬液,定血型,直抗试验同ABOHDN。(2) .当直抗阳性强度达到或超过2+或用筛选谱细胞检测患儿血清中有AB0系以外的抗体时进行以下试验。(3) .取患儿三洗红细胞进行乙醚放散,取一体积三洗红细胞加一体积AB血浆(或N.S),2体积分析纯乙醚,颠倒摇匀10分钟,然后13001500转/分钟离心5分钟 ,离心后分三层,上层为乙醚,中层为红细胞基质,下层是具有抗体放散液,为浅深红色,用干净的吸管吸取放散液,若有混浊,可再离心一次.将放散液置于37水浴中30分钟,以除尽乙醚，离心上清即为放散液,做抗体鉴定。(4) .用母亲血浆和新生儿放散液作抗体鉴定,取MGIA-Coom

20、bs卡,分别加母亲血浆40ul,患儿放散液40ul各加一套筛选谱细胞至卡内各孔， 37孵育15分钟,离心10分钟,观察并分析结果，判断母亲血浆中和新生儿放散液中存在抗体(如夫妇或母婴的ABO血型相合,则将母亲血浆直接与其婴儿红细胞作抗体筛选试验,如为阳性,就需用一组鉴定谱细胞确定抗体的特异性,抗体的特异性确定后,检查母亲红细胞上是否缺乏与其相对应的抗原.以验证抗体的可靠性,并测定抗体的效价。 HDN阳性实例及加样模拟图 附表：新生儿溶血病血清学诊断标准直抗试验游离试验释放试验结 论OOO不能证实为由血型免疫抗体引起的新生儿溶血病+OO可疑为新生儿溶血病O+O可疑为新生儿溶血病OO+可以证实为A

21、BO新生儿溶血病+O+可以证实为ABO新生儿溶血病+O可以证实为ABO新生儿溶血病+可以证实为ABO新生儿溶血病O+可以证实为ABO新生儿溶血病血型(IgG)抗体引起的HDN有哪些特点:1. ABO HDN在新生儿血型不合溶血病中发病率最高,主要发生在母亲是O型,婴儿是A型或B型的婴儿中。2. ABOHDN常发生在第一胎,而ABO之外HDN则多发生在第二胎以后的婴儿。3. ABOHDN的症状轻重差别很大,ABOHDN一般发病较轻,轻症仅出现轻度黄疸,易被视为生理性黄疸而漏检,有的仅在晚期出现贫血,重症可发生死胎,重度黄疸或重度贫血,但总的症状和体症与RhHDN相比,不论从黄疸程度,贫血轻重,肝

22、脾大小和核黄疸发生率都比较轻.此外,ABOHDN的轻重与胎次的关系不大,并不因胎次增加而加重症状，而且不同胎次中症状轻重可能相隔出现。4. 黄疸方面 ABOHDN比RhHDN轻,出现时间也较晚,多数患儿出后第2天或3天才逐渐出现黄疸.而RhHDN在出生24小时可能出现黄疸.5. ABOHDN时有不同程度的贫血,周围血象中有核红细胞和网织红细胞增多,红细胞呈多染性,但程度比RhHDN轻。6. 总胆红素增加,以未结合胆红素为主。7. 抗体检查时,由于胎儿和新生儿红细胞密度小,直接抗人球蛋白试验常为弱阳性或阴性,如将被检血加热,使红细胞上的抗体释放出来再测抗体则阳性率可以增高,另外ABOHDN时血清

23、中有游离抗体,因此间接抗人球蛋白试验常呈阳性,但游离抗体只在出生后几天存在,之后会逐渐消失,因些晚期诊断意义不大.8. 治疗分三类,换血,光疗和药物治疗,凡黄疸深,血清总胆红素在342427umol/L以上者都需换血,总胆红素在以上浓度以下者以光疗为主。9. 预后,ABOHDN中有重型病例发生死胎和新生儿死亡,A型和B型的发病率相仿.但总的死胎发生率和病死率比RhHDN低得多。（七）、孕妇产前抗体(IgG)效价监测 由于ABOHDN的发病程度与母亲(孕妇)体内IgG抗A(B)的效价有一定相关性,因此可定期检测孕妇体内IgG抗A(B)的效价来判断胎儿的受害情况,如果母体内IgG的效价随着孕期的增

24、加而增高,提示胎儿受害的可能性增大,产前监测孕妇血清IgG抗体水平并及早采取相应的防治措施对优生优育具有重要价值。试剂 微柱凝胶抗人球蛋白卡(MGIA-Coombs)卡1.配制中和血清200ul孕妇血清+200ul二巯基乙醇(2-Me应用液)(KH2PO4 1.73g，Na2HPO4.12H2O19.35g，NaCl 8g加蒸镏水到1000ml)，稀释至100ml(或加生理盐水（N.S）至100ml)2.将中和血清放37水浴30分钟(或1小时)3.将丈夫,孕妇(自制A、B、O（3人）红细胞)配成35%红细胞悬液，并分别测定ABO及Rh血型。4.孕妇IgG抗体滴度检测排6支小管(1).第一管：2

25、0ul中和血清+1280ul PBS(或N.S)(2).第2-6管分别各加入200ul PBS(或N.S)(3).从第1管吸出200ul加入第二管,混匀,再从第二管吸出200ul加入第3管,依次倍比稀释至第6管(效价分别为1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:5096)(4).于MGIA-Coombs卡中加入35%丈夫红细胞悬液或与丈夫ABO同型标准红细胞悬液10ul，再分别加40ul上述16管经中和并稀释后的血清放37水浴1015分钟。(5).专用离心机离心10分钟。(6).结果以出现凝集1+的前一管的滴度报告。5.孕妇不规则抗体筛检(1).取MGIA-Coom

26、bs卡(2).于一孔内加入35%自制“”型红细胞悬10ul，再加入40ul孕妇血清(3).37水浴10分钟(4).专用离心机离心10分钟(5).判断结果如为阳性则应用谱细胞作抗体鉴定，以确定抗体的特异性，注：1.父亲为型测抗（IgG），父亲为型测抗B（IgG）父亲为AB型测抗A(IgG) 、抗B（IgG） 2.“O”细胞筛检如为阳性则说明孕妇体内可能含有ABO以外的不规则抗体3.采用MGIA法比试管Coombs试验灵敏度高，因此建议 正常值应为IgG抗A（B）效价1：128而不能定为1：644.A、B、O细胞的配制：取正常健康A、B、O型各3人红细胞用N.S三洗(需重新复核血型无误后)配成35

27、%红细胞悬液配用。四、MGIA可能出现的问题：1.假阳性反应：（1）未完全去除纤维蛋白原的血清标本，在凝胶中形成纤维蛋白,阻碍红细胞沉降而浮于胶中或表面。（2）抗凝剂不足或不含抗凝剂的血清标本如临床上常用血袋上的接管中的标本,其中可能无抗凝剂或很少抗凝剂,而离心后取出血液中含纤维蛋白原,在MGIA反定型或次侧配血中出现假阳性。(3) 被检标本染菌也使红细胞浮于胶中或表面。(4) 被检标本红细胞破碎常常是因为该红细胞陈旧，此时即使应是阴性结果，但破碎的红细胞膜浮于胶中或胶面呈弱阳性。2假阴性反应(1).抗原或抗体过少、过弱。(2).抗原,抗体比例不合适,如前带或后带现象。(3).离心力过大,使弱

28、阳性成为阴性结果。(4).末加入抗原或抗体等人为实验操作错误。3溶血反应(1).可能是实验操作者错误或实验标本有问题。发生溶血反应不一定就是抗原抗体特异反应所致。(2).可能是因为红细胞抗原抗体溶血反应。(3).溶血的临床意义一定不能把溶血标本认定为阴性反应。要记录为溶血反应.(1).发生溶血标本所相应的血液中可能存在阳性的红细胞抗原抗体反应可能是受供者血型不同所致，此时抗体应明确为有临床意义的抗体。(2).也可能在工作中发生错误如采血针太细，实验离心力过大，致使血样溶血，要找出溶血的原因。4混合反应混合反应一般是指反应体系中同时有抗原阳性和阴性红细胞。反应格局必须为阳性和阴性结果同时存在的情

29、况。(1).不同抗原红细胞混合标本，如标本中有A型血也有O型血,对此标本用抗A检测出现的反应格局。(2).多凝集红细胞（如T/Tn），对此标本用人血清抗体试剂抗A和（或）抗B检测时应出现的结果。(3).红细胞血型亚型红细胞（如A3）对此标本血清抗A、B检测的反应格局。(4).应用指示红细胞的MGIA间接试验阳性结果。5混合反应意义及注意事项：(1).微柱凝胶免疫检测技术的主要功绩一是能够对混合标本的不同抗原性红细胞进行分离与鉴定，它是一个简便，易行，准确的分析混合标本的血型血清学的免疫检测方法.(2).对出现混合反应的标本,一定要认真分析其原因,千万不可在原因未查明之前,轻易判断血型或血型相容性.(3).在排除标本污染细菌,血液纤维蛋白析出以及不是应用指示红细胞的MGAIA间接血凝试验等情况后,可判断出现混合反应格局的标本中可能含有两种或以上特异性抗