生化药物和基因工程药物含量测定

1、药品检验技术课程单元教学设计情境：药物杂质检查(03) 任务：一般杂质检查方法(02)教学目标设计序号5上课地点理实一体化教室授课形式讲授、学生操作练习教 学 目 标技能目标知识目标生化药物和基因工程药物含量测定。药物含量测定及方法教 学 重 点生化药物和基因工程药物含量测定教 学 难 点能够根据药物含量测定及方法。能力训练任务及案例教学进程设计（下面各格均可合并）步骤教学内容教学方法教学手段学生活动时间分配基础知识的讲解药物含量测定及方法教师举例、点评、归纳概括引出知识点。做好课堂笔记案例分析分组实验讨论25分钟例如：含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量：适用于结构明确的小分子

2、药物或经水解后 变成小分子的药物。生物效价或酶活力单位：适用于酶类、蛋白质类药物。含量测定方法： 理化分析法： 化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法 色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、 灌注色谱法、HPCE法 酶法：酶活力测定法、酶分析法 电泳法 生物检定法1电化学分析法 药物膜电极 生物组织膜电极 药物电极 微生物电极 离子选择性电极法 免疫电极 免疫场效应管 酶电极 2. HPLC法 RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸 柱：RP18， 柱温：48 流动相：A-0.05% TFA；B-乙腈-异丙醇

3、（4：1） 梯度洗脱 荧光检测器：lex=280nm340nm,lem=430nm测定： 样品-肽 样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2，110，20h 24h。 样品干燥：真空 样品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/L NaOH 进样测定HPIEC 测定对象：蛋白质，多肽 柱：离子交换键合相 流动相：0.3mol/L1.0mol/L的盐的缓冲液。 梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤 素类盐 特点：可回收活性蛋白。HPGFC 应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。 示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量 的测定 柱：Beckman Ultrasphero

4、gel SEC 3000 流动相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4 （1:1）0.05%叠氮化钠应用示例：ChP（2000）重组人胰岛素的质量控制鉴别： 法1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间 应与对照品的一致。 法2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别 进行梯 度洗脱，供试品的肽图谱与对照品 的肽图谱一致。检查 检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、 干燥失重、无菌、细菌内毒素。 有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化 法计算有关物质的量不得超过3.0%。 高分子蛋白质： 固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量为50006000的球 状蛋白。流动相

5、：0.4mol/L 碳酸氢铵-乙腈（69 : 31）测定：分别测定供试液（1mg/ml）和对照液（将供试液稀释成0.01mg/ml），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不大于对照液主峰面积（限量1.0%)。效价测定： 固定相：ODS C18 流动相：硫酸盐缓冲液-乙腈（7426） 系统适用性试验：测定胰岛素主峰和A21脱氨胰岛素峰之 间的分离度与拖尾因子。含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计 算含量。3.灌注色谱法 固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构成贯穿孔 颗粒分离介质-POROSR。 双模式孔结构：80150nm大扩散孔 600800nm贯穿孔允

6、许液体传送流经过分离介质内表面，使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中，扩散作用不再是主要的。 介质颗粒内部可利用反应的表面积增加，容量和分辨率也随之增加，可使生物活性大分子快速分离纯化。方法： 取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37±0.5恒温水浴保温，记时。反应系统在3040秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法 操作，凝结块在2小时内不溶。4. 生物法： 利用生物体进行试验来鉴别药物。 例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。 利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。杂质检查 一般杂质检查 特殊杂质检查：原料药纯度分析 生产过程中杂质的检查 1. 原料药纯度分析： 多糖类-低聚糖、核酸、蛋白质 酶类药物-酶催化反应基本产物的分析， 具有一定活性的其他有关酶的检查。例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查 选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为2500个胰蛋白酶单位中不得大于50单位，