益生注射液抗大鼠腹主动脉移植硬化的实验研究

1、益生注射液抗大鼠腹主动脉移植硬化的实验研究摘要目的：探讨不同浓度益生注射液A、B两种组分及联合用药对移植物慢性失功（CAD）的防治效果及作用环节。方法：利用组织形态观察;计算机象分析;过氧化脂质测定和免疫组织化学分析大鼠腹主动脉移植硬化加快模型。结果：术后6周A+B及骁悉（MMF）治疗组能显著抑制血管内膜的增厚，B（10 mg.kg-1）、B(1 mg.kg-1)、A+B组术后各期过氧化脂质（LPO）与术前比无明显差异，各组TGF-1表达高峰在术后2周，空白对照组各时间点的表达最强，A+B及MMF组表达最弱。结论：A组分通过抑制T、B淋巴细胞及巨噬细胞增殖、浸润，间接下调TGF-1的表达，B组

2、分对氧自由基引起的损伤有明显保护作用，A+B有协同作用，其作用与MMF单用相当。关键词益生注射液；大鼠；腹主动脉移植中分类号：R969文献标识号：A文章编号：1006-0103（2000）03-0185-04EXPERIMENTAL STUDY ON YISHENG HERBAL INJECTION ANTIABDOMINAL AORTA SCLEROSIS OF TRANSPLANTATIONBU Hong CHEN Wei-guoLIU Yu-binWU Da-rongCHENG Jing-qiuWANG Li（The First University Hospital, West Chi

3、na University of Medical Sciences, Chengdu 610041 China）Abstract OEJECTIVE:To investigate the precluding effect and processing step of the Yisheng herbal injection in different concentration and coalition usage against CAD. METHODS: By abdominal aorta transplantational sclerosis model in rats.RESULT

4、S: Thickenning of endovascular could be inhibited significantly in 6 weeks after operation and MMF treatment group.There is no significant difference in LPO of B(10 mg.kg-1)、B(1 mg.kg-1)、AB(5 mg.kg-1) between pre-operation and after operation. The peak of TGF-1 expression was in 2 weeks after operat

5、ion. Each time point in control has the highest expression, where as A+B and MMF group have the lower expressions. CONCLUSION: The results suggest that a medicine down-regulate indirectly TGF-1 expression by inhibiting hyperplasia and infiltration of T、B lymphocytes and macrophage. B medicine plays

6、a protection role for injury caused by oxygen free redical. A+B have the coordinated action which is the same as MMF Key wordsYisheng injection; Abdominal aorta transplantation慢性失功（CAD）是影响移植物长期存活的主要障碍之一，肾移植术后10年，CAD发生比例仍高达20%30%1。迄今尚无满意的治疗药物，常规三联免疫抑制剂不能阻止CAD进程。从传统中医药宝库中去探索治疗CAD的有效药物具有重要意义。1材料与方法1.1材

7、料雄性封闭群SD与Wistar大鼠(华西医大实验动物中心)各105只，23月龄，体重（20020）g采用腹主动脉移植硬化加快模型（移植段血管缺血24 h），行SDWistar腹主动脉移植。丙二醛试剂盒（100人份，南京建成公司)。TGF-1多抗（130）(北京中山公司)。益生注射液A组分（30 mgml-1）、B组分（20 mgml-1）(成都市药物制剂研究所)，该注射液是由岩黄连、四棱草、凤凰爪等多种天然药物提取而得的静脉注射液,其有效成分已分别用于临床，但尚未见用于抗移植慢性失功的报道。术后第一天起，经腹腔注射给药。MMF（每粒500 mg，瑞士罗氏公司）术后第一天起灌胃给药（20mgkg

8、-1）。1.2方法将受鼠随机分为I、II、III、IV、V、VI、VII七组，每组15只，分别于术后1周、2周、6周各处死5只，其中I组为空白对照组、VII组为MMF阳性对照组，以上两组供鼠腹主动脉取下后置04高渗枸橼酸腺嘌呤液(HCA)保存备用，II、III、IV、V、VI组分别为A大（6 mgkg-1）、A小（1 mgkg-1）、B大（10 mgkg-1）、B小(1 mgkg-1)、A（3 mgkg-1）+B（5 mgkg-1）给药组，供鼠腹主动脉取下后分别置于04A大（480 gml-1）、A小（120 gml-1）、B大（500 gml-1）、B小（125 gml-1）、A（240 g

9、ml-1）+B（250 gml-1）中保存备用。1.3标本采集与检测按观察时间点切取植入段腹主动脉，石蜡切片，行HE染色，光镜观察组织学改变。采用计算机像分析系统，将HE染色结果经光镜放大400倍后输入计算机，对像进行灰度换算，自动测出移植的腹主动脉内膜、中膜层面积，计算出内膜厚度内膜厚度=内膜面积（内膜面积+中膜面积）2。1.3.1过氧化脂质（LPO）测定受试鼠术前颈外静脉插管，分别于术前、术后2、4及24 h抽取静脉血0.3 ml，肝素抗凝，1500 rmin-1离心10min。取0.1 ml血清，用丙二醛试剂盒在UV-1601PC（日本岛津）紫外分光光度仪下测定氧自由基代谢产物之一的丙二

10、醛水平，以反映氧自由基对细胞损伤程度。1.3.2免疫组化检测转化生长因子1（TGF-1）在移植段血管壁的表达石蜡切片，LSAB法3，由两名经验丰富的病理科医生光镜下盲法读片，按着色程度不同分为0级（无明显着色），1级（少量着色），2级（中量着色），3级（大量着色）。1.4统计学方法实验计数资料结果均以SD表示，采用SPSSV8.0进行统计分析，P0.05时有统计学意义。2结果2.1腹主动脉内膜厚度的变化2周时，I组内膜厚度为0.2250.120，与术前比明显增厚，治疗组内膜增厚不明显，6周时，VI、VII组内膜厚度分别为0.1270.097、0.1280.076，组间无显著差异（P0.05），

11、而与A组同期（0.2710.087）相比差异显著（P0.01）(1)。1腹主动脉内膜厚度的变化Fig1 Changes in thickness of the endothelium of abdominal aorta2.2腹主动脉组织病理变化正常大鼠腹主动脉，内皮细胞扁平，呈单层紧密连接，中膜由46层弹力纤维构成，其间散在多量梭形平滑肌细胞（SMC），外膜较薄，由致密结缔组织组成。缺血24 h组SDWistar移植后6周，内膜明显增厚，中膜SMC坏死较重，各层炎细胞浸润较重。缺血24 h组SDWistar移植，A+B治疗后6周，内皮细胞稍多，中膜层SMC可见坏死，各层炎性细胞浸润均较轻。缺

12、血24 h组SDWistar移植，MMF治疗后6周，内皮细胞稍多，中膜层SMC可见坏死，各层炎性细胞浸润均较轻。2.3血清LPO变化I、II、III三组术后2 h血清LPO值较术前明显升高（P0.05），术后4、24h与术前比无明显变化，使用B组分治疗的IV、V、VI组，术后各期与术前比无明显差别(2)。2血清LPO变化Fig 2 Changes in serumal LPO2.4腹主动脉壁TGF-1的变化各组TGF-1表达高峰均在术后2周，A组各时间点TGF-1的表达最强，、组表达最弱，其余各组介于其间(表1)。表1TGF-1在各组中的表达Table 1 Expression of TGF-

13、1 in each groupGroup1week2week6week0123023012313141122322322122122212122322122124112213131131113321313讨论 CAD是免疫因素和非免疫因素共同对移植物的损伤形式，前者指由于组织不相容而导致的对外来抗原的免疫反应，在移植失功中起关键作用。后者包括缺血/再灌注（I/R）损伤、巨细胞病毒感染、高脂血症、术后高血压、免疫抑制剂的毒性作用等。随着对CAD机理了解的不断深入，非免疫因素在CAD中的作用越来越受到重视。Land4等提出理想的免疫抑制剂需具备以下五个标准。对改善患者生存质量无负面影响；能有效抑制

14、和防治急、慢性排斥反应；能最大限度降低与CsA相关的肾毒性、感染发生率及肿瘤发生率；适用于各种临床移植；价格合理。目前尚无一种既能逆转急性排斥反应，又能抑制CAD的理想药物。因此，寻找有效、安全、价廉的防治药物迫在眉睫。3.1LPO在CAD中的作用血清中LPO由氧自由基氧化细胞膜及血中低密度脂蛋白而来，有显著致动脉粥样硬化作用。由于氧自由基对移植物的损伤是I/R损伤的同义词，随缺血时间延长，I/R损伤加重LPO值逐渐升高。检测血清中LPO值可反映I/R对移植物的损伤程度。本研究显示各组LPO峰值均在术后2小时，提示血管内皮细胞损伤高峰发生在术后2小时，早期抗I/R损伤意义重大。3.2TGF-1

15、在CAD中的作用TGF-1由血小板、T细胞、系膜细胞和单核、巨噬细胞等分泌，具有多向调节功能，最终导致细胞外基质合成增加，降解减少，刺激SMC增殖、迁移，引起移植物功能不断恶化5。本研究显示各组TGF-1高峰均出现在术后2周，此时SMC增殖、迁移明显，6周时TGF-1表达下降，SMC增殖、迁移减弱。提示早期抗炎治疗可能延缓CAD的发展。3.3MMF的作用6,7MMF通过可逆性抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶，特异性抑制T和B淋巴细胞中的嘌呤经典合成途径抑制淋巴细胞增殖，继而抑制抗体形成和SMC增生，是目前公认既能抑制急性排斥反应，又能用于治疗慢性排斥的药物。故选作阳性对照。本实验中见到MMF组术后各

16、时相炎性细胞浸润均较轻，2周、6周内膜增厚也不明显。3.4益生注射液A组分的作用A组分的有效成份为生物碱，体内实验能明显抑制小鼠T、B细胞和巨噬细胞活性，具有抗菌消炎，抑制红细胞溶血等作用。移植段腹主动脉受到I/R损伤后，淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润增加，分泌转化生长因子1（TGF-1）并提高SMC上血小板样生长因子（PDGF）-、受体表达及其对外源性PDGF的反应性，使SMC增殖、迁移，启动动脉硬化进程8。采用A药治疗后LPO未见明显下降，但内膜增厚及TGF-1的表达较未治疗组轻，推测其通过下调TGF-1的表达而发挥治疗作用，A大作用强于A小，提示作用呈剂量效应关系。3.5益生注射液B组

17、分的作用缺血时由于氧及能量缺乏可导致细胞肿胀，甚至破裂；再灌注更加重受损细胞及白细胞释放氧自由基及毒性代谢产物，氧化细胞膜及血中的低密度脂蛋白，形成具有很强致动脉粥样硬化作用的氧化型低密度脂蛋白。B是活血化淤类中药，能明显抑制血小板聚集，降低血流粘滞度，促进微动脉血流恢复，改善微循环。同时对动脉硬化进程中的组胺有明显抑制作用，并可通过明显抑制血中及缺血再灌注时组织中氧自由基损伤的主要代谢产物之一的丙二醛（MDA），保护抗氧化酶系统和ATP酶活性，减轻氧自由基对组织的损害。B治疗后LPO值于术后2小时未见明显升高，术后内膜增厚及TGF-1的表达均较未治疗组轻。B小较B大有效，推测可能因大剂量B对

18、一氧化氮合成酶有轻度的抑制作用；另外大剂量B可减少抗氧化剂如谷胱苷肽的产生。3.6A+B的作用影响CAD的因素众多，包括免疫因素和非免疫因素，这两类因素之间有协同作用。A、B两药联合使用分别作用于不同环节，从不同环节打断CAD的恶性循环，因而效果较好，其作用与MMF单用相当或略优。本研究显示，A、B、A+B、MMF均可不同程度缓解CAD发展。A可下调TGF-1的表达（A大作用强于A小）；B能降低LPO（B小作用强于B大），A+B有协同作用，其作用与目前公认最好的抗慢排药MMF单用相当或略优，但价格较MMF明显降低，可望推向临床。作者简介： 步宏，男，医学博士，副教授，从事移植病理学工作。*现工

19、作单位成都军区总医院步宏（华西医科大学附属第一医院，四川 成都610041）陈卫国（华西医科大学附属第一医院，四川 成都610041）刘于宾（华西医科大学附属第一医院，四川 成都610041）吴大蓉（成都市药物制剂研究所，四川 成都610072）程惊秋（华西医科大学附属第一医院，四川 成都610041）王莉（华西医科大学附属第一医院，四川 成都610041）参考文献1，Knechtle S. Chronic rejection: The clinical problem. J.Graft, 1998, 1(2 supple II): 472，Motomura N, Lon H, Maurice

20、 P, et al. Acceleration of arteriosclerosis of the rat aorta allograft by insulin growth factor-1J. Transplantation, 1997, 63(7): 9343，苏红，谷代平，胡海霞LSAB法与ABC法免疫组化染色敏感性的对比研究J中国组织化学与细胞化学杂志,1995, 4：2964，Land W. Clinical immunosuppressive matrix in organ transplantationJTransplant Proc.1994, 26:24795.5，Sharma VK, Li B, Ding R, et al. Chronic allograft n