髓鞘碱性蛋白基因与多发性硬化相关性的研究

1、    髓鞘碱性蛋白基因与多发性硬化相关性的研究        【摘要】目的探讨中国人群中多发性硬化（MS）的遗传易患性与髓鞘碱性蛋白基因5端四核苷酸重复序列多态性的相关性。方法以28例确诊MS患者及47名正常对照为研究对象，从外周血白细胞中提取DNA，利用聚合酶链反应技术特异性扩增MBP基因5端四核苷酸重复序列，并通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的多态性。结果发现四种等位基因，片段大小为1.06 kb, 0.98 kb, 0.61 kb和0.54 kb，以前两种多见。1.06

2、 kb基因片段在女性中出现频率很高，达73%，MS组与对照组无差别。男性中1.06 kb基因片段出现频率MS组(69%)明显高于对照组(39%)。MS组中等位基因的分布无性别差异。结论中国人群中MBP基因第一个外显子5端四核苷酸重复序列多态位点等位基因的分布有性别差异，1.06 kb的等位基因片段可能与MS易患性相关。【关键词】致脑炎碱性蛋白质类多发性硬化基因聚合酶链反应The association between myelin basic protein gene and multiple sclerosisZHANG Yanqing， XIE Ruping.Deptartment of

3、Neurology, The Third School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100083【Abstract】Objective To investigate whether the polymorphism of the tetranucleotide repetitive sequence located 5 to the MBP gene exon 1 contributes to the susceptibility to multiple sclerosis in Chinese popul

4、ation. Methods Twenty-eight unrelated patients with multiple sclerosis and forty-seven control subjects were included in this study. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and amplified using the polymerase chain reaction (PCR) to characterize the tetranucleotide repetitive seque

5、nce located 5 to the MBP gene first exon. The PCR product was analyzed through agarose gel electrophoresis. ResultFour alleles were obtained, with fragment size of 1.06 kb, 0.98 kb, 0.61 kb and 0.54 kb. Alleles with the size of 1.06 kb and 0.98 kb were most frequently seen. High frequency, 73%, of 1

6、.06 kb allele was observed in females no matter which groups (MS or control) they were in. Among males, the 1.06 kb allele was more frequently seen in MS group (69%) than in control group (39%). There was no difference in the distribution of these alleles between male and female patients with multip

7、le sclerosis. ConclusionThere is different distribution of the AmFLP (amplification fragment length polymorphism) alleles located 5 to the MBP gene exon 1 in male and female in Chinese population. The 1.06 kb allele may be associated with the susceptibility to multiple sclerosis.【Key words】Encephali

8、togenic basic proteinsMultiple sclerosis Genes Polymerase chain reaction多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是中枢神经系统中常见的慢性脱髓鞘疾病，病因至今未明。大量流行病学及统计资料表明，MS发生与环境、遗传因素均有关1。迄今的研究支持MS是遗传易患个体暴露于某种环境因素后而发生的自身免疫过程2。 髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）是髓鞘的重要组分，是诱发 MS的实验动物模型实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）的主要抗原。MBP基因是否为MS的易感基因尚无定论3-5。本研究

9、以中国MS患者为对象，旨在探讨MBP基因是否与我国的MS遗传易患性相关。对象和方法一、临床资料1MS组：MS患者共28例，男8例，女20例，年龄1862岁，平均40岁，均为汉族人。是1996年11月至1998年2月北京医科大学附属第三医院17例、北京医科大学附属第一医院4例、北京医科大学附属人民医院6例、宣武医院1例神经科住院及门诊患者。均符合Poser等6的MS诊断标准，患者间无亲缘关系。2对照组：共47例，男23例，女24例，年龄2589岁，平均46岁。均为汉族人, 个体间无亲缘关系，为无神经系统脱髓鞘病史及家族史的正常人。二、研究方法应用标准方法7 从研究对象外周血白细胞中提取高分子量D

10、NA，利用PCR技术特异性扩增目的基因片段。上游引物为5GGTACATTACACCTAT-TTGG3, 下游引物为5GGATTCACTCACATA-TTCCT3。PCR条件为94变性50秒，54退火50秒，72延伸80秒，共35次循环。并经琼脂糖凝胶电泳来确定每一DNA扩增产物片段大小。三、统计分析 采用列联表资料的2检验，无效假设为MBP基因5端重复序列的AmFLP (扩增片段长度多态性)等位基因频率无组间差异。结果一、MBP基因扩增片段长度多态性分析应用PCR技术特异性扩增了MBP基因5端的四核苷酸重复序列，并通过琼脂糖凝胶电泳获得了清晰可辨的四种大小的片段，每一种片段都是所扩增位点的一个

11、等位基因。这四种等位基因片段大小分别为A1=1.06 kb, A2=0.98 kb, A3=0.61 kb, A4=0.54 kb (1) 。 1：0.61 kb纯合子；2：1.06 kb/0.61 kb杂合子；3：1.06 kb/0.54 kb杂合子；4：相对分子质量标准；5：1.06 kb纯合子；6、7为1.06 kb/0.98 kb杂合子1MBP基因5端四核苷酸重复序列AmFLP等位基因相对分子质量标准(4泳道)，由DNA EcoR I/Hind 相对分子质量标准与1 085 bp相对分子质量标准组成；其余各泳道均为PCR扩增产物二、相关性分析对28例MS患者及对照组的47名对象做了MB

12、P基因AmFLP 等位基因分析。A1及A2在实验对象中出现频率较高，A3及A4仅个别出现。结果显示:（1）女性MS组与对照组等位基因的分布无差别，A1最多见，达73%；（2）男性两组的等位基因分布有显著差别，MS组和对照组A1出现频率分别为69%和39%，A2在两组中出现情况与A1相反；（3）MS组等位基因分布无性别差异；（4）对照组等位基因分布的性别差异显著，女性A1多见(73%)，男性A2多见(59%)，见表1。表1MBP基因AmFLP等位基因在对照组与MS组不同性别中分布差异的比较MBP等位基因对照组染色体数(%)MS组染色体数(%)女a男b女a男bA1A235(73)10(21)29(

13、73)8(20)A32(4)1(2)3(7)0(0)A41(2)0(0)0(0)0(0)合计48(100)46(100)40(100)16(100)注：A3、A4数量极少, 故在统计检验中忽略不计，仅进行A1、A2分布差异的比较。a： 两组女性的比较，2=0.04，P>0.05；b： 两组男性的比较，2=3.92，P<0.05；c： 对照组男女间的比较，2=13.26，P<0.005 ；d： MS组男女间的比较，2=0.16，P>0.05讨论实验发现了四种等位基因A1 (1.06 kb)、A2(0.98 kb)、A3(0.61 kb)、A4(0.54 kb)。由于A3、

14、A4仅在个别病人及对照组中出现，故无法分析其意义。本实验MS组女性患者占70%，在对照组女性占51%，而MS在女性中多见，性别组成比不同可能会影响实验结果。为了去除性别因素对实验的影响，将实验对象分为女性MS组、男性MS组、女性对照组和男性对照组四小组，前三组的等位基因分布无统计学差异，A1的频率明显高于A2，而在男性对照组中情况正相反，A2的频率高于A1。对照组的资料提示MBP等位基因的分布有性别差异，A1大片段在女性中多见。而男性MS患者在A1、A2的频率分布上与女性无差别，且男性MS患者A1大片段的频率显著高于对照组男性中A1的频率，提示A1与MS相关。综合以上分析，我们认为MBP多态性

15、等位基因分布可能既与性别有关，又与MS疾病有关。与许多自身免疫疾病 (如系统性红斑狼疮、重症肌无力)一样，MS以女性多见，本实验中女/男比率为2.5。女性MS发病率高，且女性中A1出现频率很高，这种平行关系以及男性中A1与MS相关，提示MBP基因可能与MS的易患性有关。因此我们假想，1.06 kb(A1)的MBP基因片段决定了女性对MS易患的一种遗传素质，而女性中可能还存在着另外一种或几种保护因子，当其存在时便会保护女性免于患病，缺乏保护因子则易患病；在男性中，1.06 kb的MBP基因片段出现频率低，使得男性对MS不易患，由于性别差异的影响男性缺乏女性所具有的保护因子，因此1.06 kb基因

16、片段在男性中出现时, 便更易发挥其决定对MS易患的作用。MBP基因5端四核苷酸重复序列是不是MBP基因功能的重要组成部分，以及该位点不同等位基因是否会影响MBP基因的表达，目前尚不清楚。另外，发现MBP基因多态位点与MS相关还不能充分说明它就是MS的易感基因，它也可能只是作为MBP基因功能编码区或调节区的一种非特异性标志，或是作为18号染色体上紧邻MBP基因的其他基因的一种非特异性标志，即该位点只是与MS易患基因 (可能是MBP基因的其他位点或其他基因)相连而已。实验也发现并非所有患MS女性都具有1.06 kb基因片段，也并非所有具1.06 kb片段纯合子的男性都会患病，这也说明还有其他因子参

17、与MS发病，这与多种因子 (包括多基因、多种环境因子)1，8 参与MS发病的理论是一致的。我们在实验中还发现了两种小片段的等位基因 (A3-0.61 kb、A4-0.54 kb)，它们与A1-1.06 kb、A2-0.98 kb相差300500 bp，这在其他学者的研究中尚未见报道，这些小片段等位基因的出现有何种意义，是由何种突变造成的，尚有待于更深入广泛的研究。作者单位：100083 北京医科大学第三临床医学院神经科参考文献1McDonald WI. The mystery of the origin of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psy

18、chiatry, 1986,49:113-123.2Bansil S, Cook SD, Rohowsky Kochan C. Multiple sclerosis: immune mechanism and update on current therapies. Ann Neurol, 1995, 37 Suppl 1: S87-101.3Tienari PJ, Wikstrom J, Sajantila A, et al. Genetic susceptibility to multiple sclerosis linked to myelin basic protein gene. Lancet, 1992, 340:987-991.4Eoli M, Milanese C, Salmaggi, et al. The myelin basic protein gene is not a major Susceptibility locus for multiple sclerosis in Italian patients. J Neurol,