13秋基因工程复习提纲

1、第一章绪论基因工程概况1、第一个实现 DNA重组的人，现代基因工程的创始人中心的P.Berg2、基因工程诞生的元年 基本模式为标志3、基因工程概念、理论依据、基本技术路线、主要内容（基因工程的上游操作过程可简化 为：切、接、转、增、检）及基本要素。基因工程的现实应用方面4、1972年，美国斯坦福大学医学1973年，以科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程的第二章 基因克隆所需的工具酶1、和2、基因工程使用的工具酶的种类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中以限制性内切酶 DNA连接酶为主的多种工具酶的发现和应用，为基因操作提供了十分重要的技术基础。限制性核酸内切酶的类型（I、II、

2、山类）第四个字母表示菌命名（一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，（品系），即属名+种名+株名。）基本特性（回文序列，Palindromes，段自我互补的 DNA顺序，有对称轴，即上下链 从5'73方向所读的顺序完全一样）。通常双链DNA被酶切后可出现三种形式的末端：5'突出的粘末端；3'突出的粘末端;平末端。切割频率：识别序列的频率=（1/4） n（n代表识别序列的碱基数目）3、同裂酶（isoschizomers）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这 类酶称为同裂酶。同尾酶（isocaudamer）:这一类的限制酶来源各异，识别的靶

3、字序列也不相同，但产生 相同的粘性末端。稀切酶：有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶，在基因操作中使用稀切酶可获得大的片段。4、星性（Star）活性产生的原因DNA，这种某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割 现象称为Star活性。在非最适的”反应条件下（包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等）,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 动”从其正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。5、DNA连接酶的连接机理： DNA连接酶是一种封闭 DNA链上缺口酶，借助 ATP或NAD 水解提供

4、的能量催化 DNA链的5'-P04与另一 DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻 DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶：大肠杆菌 DNA连接酶、T4 DNA连接酶、Tsc DNA连接酶。DNA片段的连接方法：互补黏性末端片段之间的连接、平末端片段之间的连接、片段 末端修饰后进行连接。6、DNA修饰酶的种类和功能DNA大分子称之为载体。第三章基因克隆的载体1载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的2、载体的分类按构建克隆载体 DNA的来源分类: 质粒载体 噬菌

5、体载体 病毒载体 质粒与病毒或噬菌体 DNA组成的载体 质粒与染色体DNA片段组成的载体 其它克隆载体按克隆载体的用途分类: cDNA克隆载体 转录载体 表达载体 普通载体按应用对象分类: 原核生物基因克隆载体 酵母基因克隆载体 植物基因克隆载体 动物基因克隆载体3、作为一个理想的克隆载体 DNA分子必须具备以下基本条件： 针对受体细胞的可转移性：携带外源基因片段进入受体细胞，并在细胞内稳定存在， 这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。 自主复制功能：能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达（自主复制或整合到染色体DNA上随其复制而同步复制）；DNA片段插

6、入 具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源 其中； 具有容易检测的筛选标记； 载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； 在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。4、质粒的一般生物学特性 自主复制性：质粒 DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 不亲和性（不相容性）：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒， 不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 可转移性：在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞

7、内 转移到另外一种宿主内。宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质 显性质粒和隐蔽质粒： 粒。反之称为隐蔽质粒。5、质粒克隆载体构建的基本原则ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止 选用合适的出发质粒：含必备的元件，如 子 正确获得构建质粒克隆载体的元件 组装合适的选择标记基因 选用合适的启动子 构建过程力求简单6、常用质粒 大肠杆菌质粒载体 病毒（噬菌体）载体（柯斯质粒的概念：一类人工构建的含有入DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。） 人工染色体克隆载体种类（包括酵母人工染色体（YAC ）

8、、细菌人工染色体（BAC ）、P1派生人工染色体（PAC）、哺乳动物人工染色体 （MAC ）和人类游离人工染色体 （HAEC ）。）7、 多克隆位点（MCS）： 一段用于插入外源 DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的 限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的，可以定向克隆防止载体自我连接。第四章目的基因的分离1、目的基因的制备的方法 直接分离法 构建基因组文库分离法 构建cDNA基因文库分离法 聚合酶链式反应技术扩增目的基因 基因的化学合成比较基因组文库和 cDNA基因文库的原理、构建、特点。2、基因组 DNA文库、cDNA基因文库的概念、构建过程及特点计算重组

9、子数目的公式，即：N=ln （1-P）/In（ 1-f）DNA式中N为所需的重组子的数目；f为单个重组体中插入片段平均大小与基因组总量之比；P为选出某一基因的概率（通常期望为99% ）。3、PCR原理、步骤4、 基因的化学合成方法：全片段酶促连接法+酶促填充法5、 天然DNA是指存在于生物体内的 DNA，包括：染色体 DNA、病毒和噬菌体 DNA、质 粒DNA、线粒体和叶绿体 DNA。6、分离提取核酸的主要步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离和抽提。第五章 重组基因导入受体细胞1、 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞 （host cell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA 并使其稳定维持的

10、细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。便于重组DNA分子的导入；能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选；遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的 高效分泌表达。2、作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：在遗传密码的应用上无明显偏倚性；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达; 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。3、基因工程中常用的受体细胞类型：原核生物细胞：至今被用作受体菌的主要有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌（蓝藻）等。 真核生物细胞（真菌细胞、植物细胞、动物细胞）4、重组DNA分子导入原核细胞的方法5、重组DNA分子导入真核细胞的方法6、重组子的筛选方法7、报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导 入寄主细胞（器官或组织）