动物对长角血蜱幼虫感染的免疫应答

1、动物对长角血蜱幼虫感染的免疫应答动物对长角血蜱幼虫感染的免疫应答寄生虫与医学昆虫学报 2000年第1期第7卷 著述作者：赵忠芳孔繁瑶杨汉春纪炳纯单位：赵忠芳（南开大学生物系，天津，300071）；孔繁瑶（中国农业大学，北京，100094）；杨汉春（中国农业大学，北京，100094）；纪炳纯（南开大学生物系，天津，300071）关键词：长角血蜱；动物；免疫应答摘要长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)幼虫长时间感染Wistar大鼠后，其细胞免疫和体液免疫均被抑制。兔在长角血蜱幼虫第2次感染24h后，引起蜱叮咬处皮肤嗜酸性粒细胞聚集，表现为超敏反应。IMMUNE RESPO

2、NSE OF ANIMALS INDUCED BY LARVALHAEMAPHYSALIS LONGICORNIS TICKSZhao Zhongfang（Department of Biology,Nankai University,Tianjin 300071）Kong Fanyao（China Agricultural University,Beijing 100094）Yang Hanchun（China Agricultural University,Beijing 100094）Ji Bingchun（Department of Biology,Nankai University,

3、Tianjin 300071）AbstractThe cell-mediated and humoral immunity of Wistar rats was suppressed,these rats had been infested with larvae of H.longicornis for a long time.Immune response of rabbits to larvae of Haemaphysalis longicornis 24 hours after the second infestation revealed cutaneous hypersensit

4、ivity reaction characterized by local cutaneous eosinophilia.Key words Haemaphysais longicomis AnimalsImmune response长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)在我国分布较广，它的宿主种类广泛，包括牛、马、羊等家畜和鹿、熊、狐、兔等野生动物。它不仅自身作为病原体侵袭动物及人，还可以作为媒介传播多种病原体。通过对蜱叮咬处进行的组织学和组织病理学分析，可以了解到参与免疫反应的炎性细胞，但不同种蜱感染不同种动物所得结论不尽相同。Riek(1962)观察到对微小牛蜱(

5、Boophilus microplus)有抵抗力的牛在蜱叮咬处聚积着淋巴细胞和多形核细胞，主要以嗜酸性粒细胞为主；Allen 等(1997)报道，黄牛对全环硬蜱(Ixodes holocyclus)的再感染是由嗜碱性粒细胞引起的皮肤过敏反应：而Tatchell和Moorhouse(1970)对狗感染血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)的研究，认为蜱叮咬处皮肤的浸润细胞是嗜中性粒细胞。本实验用长角血蜱幼虫感染兔，来探讨这一问题。Inokuma 等(1994)测得长角血蜱唾液腺内含前列腺素E2，它能抑制宿主对蜱叮咬的炎性反应(Ribeiro et al.,1985)。但长

6、角血蜱幼虫长时间叮咬对宿主免疫功能会有什么影响呢?本研究对此做了初步的探讨。1材料与方法1.1实验用蜱长角血蜱饱血雌虫采自北京市房山区蒲洼乡义和村山羊体表，在实验室内产卵，并孵化出幼虫。1.2德国大耳白兔德国大耳白兔购于中国农业大学动物科技学院兔场，雄性，每只体重在2.3kg2.6kg之间，共5只，感染组3只，对照组2只。每只兔背部皮肤第1次感染500只饥饿幼虫，间隔33d后进行第2次感染，每只兔背部皮肤感染300只幼虫，对照组不感染。在第2次叮咬后的24h取材，每只兔取蜱聚集叮咬处的15mm15mm2mm两块皮肤，中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片(横切)，厚6m，用苏木素伊红和瑞氏染色

7、。1.3Wistar雄性大鼠购于北京医科大学实验动物部，每只体重250g300g，分两组，即感染组和对照组，每组4只，感染组，每只鼠背部感染约150只幼蜱，任蜱自行叮咬。蜱首次叮咬后12h，对感染组和对照组进行弗氏完全佐剂牛血清白蛋白免疫(3mg/只)，间隔7d进行二免，剂量仍为3mg/只。1次6次感染在4/5蜱饱血后进行下一次感染。第6次饱血后，间隔7d进行第7次感染，第7次幼虫饱血后进行心脏采血，进行ELISA和淋转实验。第1次采血后间隔7d，进行第8次感染，在幼虫全部饱血后进行第2次心脏采血，进行ELISA和淋转实验。1.4淋巴细胞转化试验用24孔培养板全血细胞培养，3H-胸腺嘧啶核苷(

8、3H-TdR)掺入法(杨汉春，1996)。两批实验ConA的最终浓度分别为10g/mL和8g/mL每份样品设2个复孔。置37，5%CO2培养箱54h后，加3H-TdR 2ci/孔，继续培养至72h，培养过程中，每天用微量振荡器振荡2次，每次30s。培养结束后，取出培养板，将孔内液体分别移入离心管中，并用2mL生理盐水分3次洗入离心管，3 000r/min，离心5min，弃上清液，向沉淀每管加3mL蒸溜水，振摇40s，使红细胞裂解，加入3.6%氯化钠溶液1mL，3 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀细胞加生理盐水6mL，洗2次。末次沉淀细胞加入10%的三氯乙酸溶液2mL，1 500r

9、/min，离心10min，弃上清液，重复2次；向沉淀每管加入30%H2O2 1滴，再向每管加入0.5mL浓甲酸，然后置入85烘箱中烘至体积小于0.1mL；用5mL水溶性闪烁液分3次洗入闪烁杯中，充分摇匀乳化；放入MINAXI B Tri-carb 4 000 series liquid Scintillation counter,测定计算每分钟衰变数(DPM)，计算出刺激指数(SI)，求其均值。1.5ELISA法测大鼠血清效价应用常规ELISA测牛血清白蛋白效价。通过预试验确定牛血清白蛋白的包被浓度为3g/mL,鼠血清与HRP(辣根过氧化物酶)标记羊抗鼠1gG均37作用1.5h。2结果除空白对

10、照组外(图版-1)，所有感染兔均表现皮肤过敏和炎症反应(图版-2)，蜱叮咬处皮肤表皮和真皮浅层交界处积聚大量嗜酸性粒细胞(图版-3)，形成“cuff”结构，即在蜱的口器周围积聚多层嗜酸性粒细胞(图版-4)，偶有数量不多的嗜碱性粒细胞出现，同时伴有单核细胞浸润，胞质脱落的细胞也较多。蜱叮咬处的表皮也出现皮肤反应，表现为细胞坏死及紧邻的细胞肿胀，有的出现空泡变性，胞核淡染。真皮浅层毛细血管内炎性细胞较多，有充血及出血现象。1未感染长角血蜱幼虫的兔皮肤组织切片（苏木素伊红染色，164)1Unexposed to Haemaphysalis longicornis larvae skinhistolo

11、gical section (Haematoidin-Eosin staining,164）2感染长角血蜱幼虫的兔皮肤有损伤和炎症反应，其附近有一虫体（苏木素伊红染色，41)2 Exposed to Haemaphysalis longicornis larvae skin,the picture showed the damageand inflammation,there is a larva near the wound(Haematoidin-Eosin staining, 41）3感染长角血蜱幼虫部位嗜酸性粒细胞浸润（苏木素伊红染色，410)3Exposed to Haemaphys

12、alis longicornis larvae skin,eosinophil infiltration(Haematoidin-Eosin staining,410）4感染长角血蜱幼虫部位嗜酸性粒细胞积聚,形成“cuff”结构（瑞氏染色，164)4Exposed to Haemaphysalis longicornis larvae skin,eosinophil building up a “cuff”structure(Wright staining,164）2.1幼虫感染大鼠细胞免疫的影响Wistar大鼠在受到长角血蜱幼虫感染7次和8次后，外周血ConA诱导T淋巴细胞转化的刺激指数都低

13、于相应的对照组。经t检验，第7次感染，差异显著P0.05；第8次感染差异极显著，P0.01。表明长角血蜱幼虫感染使得大鼠T细胞转化能力下降。详见表1。表1鼠T细胞对ConA应答的增殖反应Tab.1ConA proliferation response of T cells in rats处理TreatmentSI平均值SDAverage of SISD感染组Infection8.71.118.22.4(b)对照组Control13.33.3*39.33.4*注：*为第7次感染(7th infection)，差异显著；*为第8次感染(8th infection)，差异极显著2.2幼虫感染对大鼠体

14、液免疫的影响鼠血清以1：800开始做2倍比稀释，HRP标记的绵羊抗鼠IgG以1：1 000稀释。阴性血清为未感染未免疫大鼠血清，稀释度都为1：670。从表2中可以看出：感染组和对照组相比，大鼠血清效价有所下降。表2ELISA法测得大鼠血清效价Table 2Serum titer of rats detected by ELISA组别Groups大鼠数量Number of rats血清效价Serum titer感染组Infection 41:25600(3只)-1：102400(1只)对照组Control41：102400注：OD值0.2为阳性，感染组有一只效价在1102400时OD值=0.2；

15、对照组4只在效价为1102400时OD值均0.2，但此后没有进一步稀释检测。3讨论嗜酸性粒细胞，尤其是构成其颗粒的主要基础蛋白质体外试验有抗寄生虫的作用。啮齿动物用抗嗜酸性粒细胞血清处理后，与未处理的比较，荷蠕虫数较多，体内试验也表现出嗜酸性粒细胞有抗寄生虫感染的作用(刘约翰和赵慰先 1993)。动物被蜱叮咬一次后，对蜱产生拒绝是过敏反应所致的结论由以下两方面观察得来：首先是致敏牛在蜱再次感染后，蜱叮咬处皮肤出现严重渗出，动物开始搔痒不安，可能是致敏肥大细胞表面结合抗蜱唾液物质抗体，再次遇到该唾液抗原后导致肥大细胞脱颗粒释放组胺等介质，使蜱叮咬处出现炎性反应，改变附近毛细血管的渗透性，出现水肿

16、，造成不利于蜱叮咬的环境；粒细胞趋化因子的作用，吸引嗜酸性粒细胞等效应细胞积聚于蜱叮咬处，直接作用于蜱，并继续释放介质。其次是牛对蜱的免疫应答组织学观察发现蜱叮咬处嗜酸性粒细胞大量积聚(Riek,1962)。Brown等(1984)在蜱叮咬处发现嗜碱性粒细胞，而嗜碱性粒细胞也可以和肥大细胞一样特异性致敏，再次遇到该种抗原脱颗粒释放组胺等介质，作用于嗜酸性粒细胞等效应细胞，因而认为嗜碱性粒细胞在蜱感染方面占主导地位。Brown等(1984)认为牛对美洲花蜱产生抗性与皮肤嗜碱性粒细胞的应答有关。豚鼠对美洲花蜱的免疫也是依靠嗜碱性粒细胞的应答，并且有T组胞和IgG1抗体参与(Brown和Askena

17、se,1981;Brown et al.,1982).牛对微小牛蜱的免疫抗性被认为是依赖肥大细胞的皮肤过敏反应，特征是皮肤有嗜酸性粒细胞浸润。本次实验应用长角血蜱幼虫感染兔，首次用500只幼虫致敏，第二次用300只攻击，蜱叮咬处仍以嗜酸性粒细胞浸润为主，偶有少量嗜碱性粒细胞出现，主要表现为型过敏反应。这与Ushio 等(1993)关于长角血蜱幼虫感染WBB6F1-+小鼠所得结论相一致。虽然有大量实验证明硬蜱多次感染动物，可以使动物获得部分保护力，但是也有关于硬蜱感染动物使得宿主免疫功能被抑制的报道，Wikel(1982)用安氏革蜱(Dermacentor andersoni)感染豚鼠，能抑制体

18、外培养的豚鼠T细胞对ConA和PHA增殖应答反应，抑制程度最大的是在第一次感染之后，而第二次感染很可能因宿主产生抗体，中和再次进入宿主体内的抑制因子，使抑制程度降低。通过给受感染豚鼠免疫绵羊红细胞，进行溶血试验，发现第一次感染组血清效价比对照组低，而在第二次感染后的第4d已恢复正常，意味着安氏革蜱感染引起的免疫抑制可能持续时间不长。Woodman 等(1990)认为在刚果革蜱(Dermacentor congolensis)抗原存在下引起Th细胞的应答。蓖子硬蜱(Ixode ricincus)若虫第一次感染BALB/c小鼠，在蜱叮咬处CD4+与CD8+比率为2.21；第二次和第三次感染后，叮咬处二者比率分别为3.21和4.71(Mbow et al.,1994)。蜱对宿主免疫抑制机制的建立，增加了蜱在免疫胁迫的环境中生存的能力。Inokuma 等(1993)报道微小牛蜱对牛有同样的抑制作用。Koney 等(1994)认为牛对彩饰花蜱(Amblyomma va