高速逆流色谱法分离茶黄素条件的优化

1、191分析检测 食品科学2009, Vol. 30, No. 06高速逆流色谱法分离茶黄素条件的优化王坤波 1,2,刘仲华 1,2, *,黄建安 1,2,刘 芳 1,2,龚雨顺 1,2,潘 宇 1,2,黄 浩 1,2(1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室,湖南长沙410128; 2.湖南农业大学湖南省天然产物工程技术研究中心,湖南长沙410128摘要 :优化高速逆流色谱分离 4种茶黄素的方法。两相溶剂系统为正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸(1:5:1:5:0.25, V/V,固定相为体系的上相,下相为流动相,流速为 2ml/min,仪器转速 700r/min,进样量 30mg。从茶黄

2、素复 合物中分离纯化得到茶黄素、茶黄素 -3-没食子酸酯、茶黄素 -3' -没食子酸酯和茶黄素 -3, 3' -双没食子酸酯,尤 其使得两种酯溶性茶黄素(茶黄素 -3-没食子酸酯、茶黄素 -3' -没食子酸酯达到较好的分离。 关键词 :高速逆流色谱;分离;茶黄素OptimizationofSeparationConditionsofTheaflavinsbyHigh-speedCountercurrentChromatographyWANGKun-bo 1,2,LIUZhong-hua 1,2, *,HUANGJian-an 1,2,LIUFang 1,2,GONGYu

3、-shun 1,2,PANYu 1,2,HUANG Hao 1,2(1.KeyLaboratoryofTeaScience,MinistryofEducation,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.HunanProvincialResearchCenterforNaturalProducts,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China Abstract:Inthisstudy,high-speedcountercurrentchromatography(HSCCCwasu

4、sedtoseparatetheaflavins.Theoptimized two-phasesolventsystem,flowrate,revolutionspeedandinjectionamountofHSCCCwerehexane-ethylacetate-methanol-water-aceticacid(1:5:1:5:0.25,V/V,2ml/min,700r/minand30mg,respectively.Theupperphasewasusedasthestationary phase,whilethelowerphasewasthemobilephaseofHSCCC.U

5、ndertheseconditions,fourtheaflavinsincludingtheaflavin (TF1,theaflavin3-gallate(TF2A,theaflavin3' -gallate(TF2Bandtheaflavin3,3' -digallate(TF3wereseparatedoutfrom crudeextract.Especially,twokindsofestertheaflavins,TF2AandTF2Bwerebetterseparated. K e y w o r d s :high-speedcountercurrentchro

6、matography(HSCCC;separation;theaflavins中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1002-6630(200906-0191-05收稿日期:2008-06-24基金项目:科技部国际科技合作项目(2006DFA33220; “十五”国家科技攻关项目(2004BA542C 作者简介:王坤波(1976-,男,讲师,博士,研究方向为茶叶生物化学。E-mail:wkboo *茶黄素是多酚类物质氧化形成的一类能溶于乙酸乙 酯的、具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称,其中茶 黄素(TF1、茶黄素 -3-没食子酸酯(TF2A、茶黄素 -3' -没食子酸酯(TF2B和

7、茶黄素 -3,3' -双没食子酸酯(TF3是 红茶中 4种主要茶黄素 1-2。红茶中茶黄素类的含量一 般为 0.5%2.0%,它们是红茶中的主要成分,对红茶 的色香味及品质起着决定性的作用,是红茶汤色“亮” 的主要成分,滋味强度和鲜爽度的重要成分 1-2。茶黄 素不仅是红茶的重要品质成分,而且具有多种与人体健 康有关的潜在功效,有降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗 突变、抗病毒等作用 3-11,因而受到国内外广泛关注, 并成为研究热点。由于结构的相似性,茶黄素类物质单体的分离非常困难,而直接从红茶中分离茶黄素单体更加困难, 在国 内外都很难买到茶黄素单体的标准品。为此,研究如 何利用酶工程合成

8、茶黄素,具有重要的理论与实际意 义。同时,如何采用高效分离方法制备分离茶黄素单 体,对茶黄素的科学研究和药理功能研究有极大的推动 作用。茶黄素的分离主要采用 SephadexLH-20柱色谱 12-13、 制备高效液相色谱 14-15和高速逆流色谱 12-13;15-17法。高速 逆流色谱(HSCCC是一种不使用固态支撑体或载体的液液 分配色谱技术。它无需任何固态载体,而是借助螺旋 管的同轴行星式运动实现固定相的高保留以充分分配分 离,避免了分离样品与固态载体表面发生化学反应而变 性和不可逆吸附等情况。每次分离样品结束后,管道 中残留溶剂均可冲出,不会对后续分离产生任何影响,2009, Vol

9、. 30, No. 06食品科学 分析检测 192因而分离样品均具有高回收率 18。HSCCC 已应用到茶黄 素的分离 12-13;15-17,但是两种酯性茶黄素的同分异构体 (TF2A,TF2B未达到较好的分离。本研究利用多酚氧 化酶氧化儿茶素体外合成茶黄素 19,并应用 HSCCC 从 茶黄素复合物中成功分离纯化出 4种茶黄素单体,尤其 使得两种酯性茶黄素达到较好的分离。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器茶黄素混合物的制备参照文献19。茶黄素混合物对照品(纯度 80%Sigma 公司; HSCCC 分离用溶剂(正丁醇、乙酸乙酯、甲醇等 均为 分析纯;乙腈和甲醇为色谱纯;实验用水为超纯水。

10、GS10A3型高速逆流色谱仪(配有 S1007A 型恒流泵、 8823B2UV 检测器、HW2000色谱工作站和分部收集仪 北京市新技术应用研究所;高效液相色谱仪(LC-10ATVP 系统控制器,LC-10ATVP 二元泵,SPD-M20A 二极管 阵列检测器以及 ShimadzuLC-solution 色谱工作站日本 Shimadzu 公司。1.2溶剂系统的选择本研究中应用的溶剂系统由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 -冰醋酸组成。 按照溶剂系统的比例正己烷 -乙酸乙酯-甲醇 -水 -冰醋酸(1:5:1:5:0.5、1:5:1:5:0.25、1:5:1:5:0.125, V/V,分别在室温下将其在

11、分液漏斗中混匀,饱和后即 可使用。上相主要由乙酸乙酯 -正己烷组成,下相主要 由甲醇 -水 -冰醋酸组成。1.3茶黄素的高速逆流色谱分离纯化用 S1007A 系统将正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋 酸体系的上相(固定相泵入 HSCCC 螺旋管。当螺旋管完 全充满后,以 2.0ml/min 的流速泵入正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸的下相(流动相,同时将螺旋管转速调 为 700r/min。达到动力学平衡后,将样品通过进样阀注 入分离螺旋管。紫外检测波长 280nm。根据吸收峰分别 收集流分,将不同的流分分别收集、浓缩,乙酸乙酯 萃 取 , 浓 缩 干 燥 , 即 得 分 离 样

12、 品 。1.4茶黄素的 HPLC 分析茶黄素的 HPLC 检测参照文献20。2结果与分析2.1分离溶剂系统的选择溶剂体系的选择是逆流色谱分离中首要的关键环 节。因为不同的溶剂系统,具有不同的上、下相之比, 其黏度、极性、密度等性质相差甚远,对相同的成分 具有不同的溶解、分配能力,形成分配系数的差异, 对分离效果产生不同的影响。目前有关溶剂体系的选择 方法和评价体系很多,但是系统性和理论性较差,实 际操作起来比较困难。在实际工作中,溶剂体系的筛 选通常更多的是参考已知的溶剂体系,或者依据实验手 段来完成溶剂系统的优化。本研究在前人研究基础上 12-13;15-17,并结合预实验,结果发现,在正己

13、烷:乙酸乙酯:甲醇:水体系中加入不同比例的冰醋酸,可以改善分离效 果。当用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸(1:5:1:5:0.125, V/V体系分离时,4种主要茶黄素可以分离(图 1A,但 分离时间长达 1000min。当用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸(1:5:1:5:0.5,V/V体系分离时,2种主要茶黄素同 分异构体不能分离(图 1B。当用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸(1:5:1:5:0.25,V/V体系分离时,4种主要茶黄 素可以分离(图 1C,分离时间适中。由于茶黄素分子结 构中含有酚羟基,在体系当中加少量的酸,让目标样 品不电离增加有机性 21 ,从而改善了分离效果

14、。1817161514131211109876mV时间(min26242220181614121086mV时间(minB12342.2流动相流速对茶黄素分离的影响流速是 HSCCC 分离过程中一个重要因素,流速对 分离有两个方面的影响。第一是流速越快,固定相保 留越少,分离效果变差。第二是流速越快,分离时间 图 1茶黄素的 HSCCC 制备分离图谱Fig.1 HSCCC chromatograms of theaflavins under different volume ratios of hexane to ethyl acetate to methanol to water to ace

15、tic acid时间(min333027242118151296mVC1234A.1:5:1:5:0.125(V/V;B.1:5:1:5:0.25(V/V;C.1:5:1:5:0.5 (V/V。1.TF1;2.TF2A;3.TF2B;4.TF3。下图同。193分析检测 食品科学2009, Vol. 30, No. 06变短,样品不能达到理想分离。但是流速降低,分离 时间延长,峰形变宽,样品也不能达到良好分离。因 而在分离过程中应选择适当的流速条件。图 2显示了逆流色谱仪转速为 700r/min,10mg 样品溶于 5ml 流动相进 样,流速分别为 1.5、2.0、2.5ml/min 时,茶黄素

16、各组 分的分离效果。随着流动相流速的增大,茶黄素各成分 保留体积数值均相应发生变化,TF1(峰 1、TF2A 和 TF2B (峰 2和峰 3和 TF3(峰 4保留体积数值减小,分离所需的 时间逐渐缩短。但是,茶黄素各成分分离度减小,分离 效果变差。综合考虑分离度和分离时间,选择 2.0ml/min 的流速能达到较好的分离效果。上述三种流速条件下, 茶黄素成分分离大致需要 495、450、365min。 时间(minm V m V时间(min2.3进样量对茶黄素分离的影响在逆流色谱仪转速为 700r/min,流速为 2.0ml/min,进样量分别为 10、30、50m g 时,茶黄素各组分分离

17、效果见图 3。茶黄素各成分的保留体积数值均相应发生 变化,变化情况与流速增大时相似。随着进样量的增 大,茶黄素各成分吸收峰间的距离缩短,分离效果变差。结果表明进样量不超过 30mg时能达到有效分离。m V时间(min时间(min987m V图 4茶黄素混合物 HPLC 图谱Fig.4 HPLC chromatogram of theaflavins151050-5m A UT F 1时间(min510152025T F 2A T F 2B T F 32.4高速逆流色谱分离茶黄素Fig.2 Effects of flow rate of mobile phase on separation of

18、theaflavinsm V时间(minC1234A . 10m g ;B . 30m g ;C . 50m g 。 图 3进样量对茶黄素分离的影响Fig.3 Effects of injection amount on separation of theaflavins3027242118151296Cm V时间(min1234应用高速逆流色谱法,选择正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸五元溶剂系统可以将茶黄素混合物分离成 TF1、 TF2A、TF2B 和 TF3四部分。图 4是茶黄素混合物样品 的 HPLC 图谱。图 5是逆流色谱仪转速为 700r/min,进 样量为 30mg,流动相流速为

19、 2.0ml/min 时的分离图谱。 分别收集峰 1、2、3和 4,HSCCC 各流份 HPLC 图谱 见图 6。峰 1、2、3和 4分别为 T F 1、T F 2A、T F 2B 和 TF3。当分离组分中还有少量杂质时,可用含水甲醇 结晶,得到 4种茶黄素。对于部分 TF2A 和 TF2B 的混 合物,可进行二次制备分离。2009, Vol. 30, No. 06食品科学 分析检测194本研究利用溶剂体系正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸(1:5:1:5:0.25,V/V分离红茶乙酸乙酯层茶色素, 茶黄素类物质可以与儿茶素等其他酚性物质分开,分离 效果见图 7(A。应用该溶剂体系还可

20、以从绿茶提取物中 分离制备酯溶性儿茶素单体(EGCG、GCG 和 ECG。图 7(B是绿茶提取物的 HSCCC 分离图谱。 30 20100-10m A UT F 1时间(minA7550250m A UT F 2A时间(minB1007550250m A UT F 2B时间(min图 6HSCCC 各流份的高效液相色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of peak 1(A , 2(B , 3(C and 4(D in Fig.51007550250m A UT F 3时间(minA 、B 、C 、D 分别为峰 1、2、3、4的 H P L C 色谱图。3讨论溶剂体系的选择

21、是逆流色谱分离中首要的关键环 节。目前有关溶剂体系的选择方法和评价体系很多,但 是系统性和理论性较差,实际操作起来比较困难。在 实际工作中,尽管有一些可供参考的理论模型,但目 前主要还是依据实验手段来完成溶剂系统的优化。本实 验发现,采用乙酸乙酯:正己烷 -甲醇 -水 -冰醋酸五元 溶剂系统,进样量为 30mg 时,500min 就可有效地将四 种主要茶黄素分离,尤其使得两种茶黄素同分异构体 (TF2A 和 TF2B达到较好的分离效果。茶黄素的分离, 无疑对红茶酚性色素,特别是对茶红素的分离有一定的 指导作用,茶红素是多羟基的酚性色素,极性较强, 容易结合在分离材料的表面而影响分离。高速逆流色

22、谱 无需任何固态载体,而是借助螺旋管的同轴行星式运动 实现固定相的高保留以充分分配分离,避免了分离样品 与固态载体表面发生化学反应而变性和不可逆吸附等情 况。因此,利用高速逆流色谱分离茶红素,将是未来的一个研究方向。6054484236302418126m V时间(minA.红茶; B.绿茶; 1.EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯; 2.GCG (没食子儿茶素没食子酸酯; 3.ECG(表儿茶素没食子酸酯。图 7红茶和绿茶提取物的 HSCCC 制备分离Fig.7 HSCCC chromatograms of theaflavin extracts of black tea(A and gree

23、n (B3027242118151296m V时间(min图 5茶黄素的 HSCCC 制备分离图谱Fig.5 HSCCC chromatogram of theaflavins under opimizedseparationconditionsm V时间(min1002003004005001234溶剂系统为正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸(1:5:1:5:0.25,V/V, 固定相为(1:5:1:5:0.25,V/V体系的上相,以(1:5:1:5:0.25,V/V体系 的下相为流动相进行洗脱。流速:2m l /m i n ;转速:700r /m i n ;柱体积:243. 0m

24、l ;进样量:30m g ;固定相保留率:66. 3%。195分析检测 食品科学 2009, Vol. 30, No. 06参 考 文 献 :1杨贤强,王岳飞,陈留记.茶多酚化学M.上海:上海科学技术出版 社,2003:88-92.2宛晓春.茶叶生物化学M.3版.北京:中国农业出版社,2003:181-184.3MARONDJ,LUGP,CAINS,etal.Theaflavin-enrichedgreentea extractlowerslow-densitylipoproteincholesterolJ.ArchiveInternal Medicine,2003,163:1448-1453

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