补肾化瘀祛痰方对雄激素致不孕大鼠卵巢局部调控因子的影响

1、补肾化瘀祛痰方对雄激素致不孕大鼠卵巢局部调控因子的影响中国 【摘要】 目的：观察补肾化瘀祛痰方（Bushen Huayu Qutan Recipe, BHQR）对雄激素致不孕大鼠（androgen?sterilized rat, ASR）卵巢局部调控因子的影响。方法：选择9日龄幼年SD雌性大鼠105只，随机分为病理模型组（90只）和溶媒对照组（15只），丙酸睾丸酮诱导形成ASR。造模成功的30只大鼠随机分为中药干预组和模型对照组。中药干预组用BHQR灌胃干预，模型对照组及溶媒对照组给予蒸馏水灌胃处理，疗程30 d。疗程结束后观察大鼠性周期情况，用放射免疫方法检测血睾酮和胰岛素（insulin,

2、 INS）含量，用免疫组织化学方法检测卵巢组织抑制素（inhibin, INH）、胰岛素样生长因子?(insulin?like growth factor?, IGF?)和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达。结果：BHQR不仅能明显降低大鼠血INS水平（P0.05），还能显著降低INH、IGF?和VEGF在卵巢局部的表达（P0.01）。大鼠排卵恢复率为66.67。结论：BHQR可能通过改善胰岛素抵挡，降低INH、IGF?及VEGF水平，改善卵巢内部环境，多途径、多靶点促使卵巢功能恢复，促进卵泡生长发育，诱发排卵。 【关键词

3、】 补肾化瘀祛痰方; 不育; 抑制素类; 胰岛素样生长因子; 血管内皮生长因子类; 大鼠Objective: To explore the effects of Bushen Huayu Qutan Recipe (BHQR), a compound traditional Chinese herbal medicine, on local ovarian factors in androgen?sterilized rats (ASR).Methods: One hundred and five 9?day?old SD rats were randomly divided into nor

4、mal control group (15 rats) and ASR group (90 rats). ASR was induced by subcutaneous injection of testosterone propionate, and the rat model of ASR was established successfully in 30 rats in the ASR group. Thirty ASR rats were randomly divided into untreated group and BHQR?treated group. There were

5、15 rats in each group. The rats in BHQR?treated group were intragastrically administered with BHQR. The rats in the normal control and untreated groups were intragastrically administered with distilled water. They were all treated for 30 days. The levels of serum testosterone and insulin (INS) were

6、measured by radioimmunoassay. The inhibin (INH) level, and the expressions of insulin?like growth factor?(IGF?) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in ovary were determined by immunohistochemical method.Results: None of the ASR ovulated and all the rats in the normal control group ovulated

7、. The rate of ovulation in BHQR?treated group was 66.67%. The serum concentrations of testosterone and INS in the untreated group were significantly higher than those in the normal control group (P0.05), and the serum concentrations of testosterone and INS in BHQR?treated group were decreased as com

8、pared with the untreated group (P0.05). The levels of ovarian INH, IGF?and VEGF in the untreated group were significantly higher than those in the normal control group (P0.01), and the levels of ovarian INH, IGF?and VEGF in BHQR?treated group were decreased as compared with the untreated group (P0.0

9、1).Conclusion: BHQR is an effective recipe in promoting ovulation, and the effects of BHQR on balancing the internal environment of ovary may be due to the reduction of serum INS level and decrease in the expressions of ovarian INH, IGF?and VEGF.Keywords: Bushen Huayu Qutan Recipe; infertility; inhi

10、bins; insulin?like growth factor; vascular endothelial growth factors; rats 多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS），又称StEin?Leventhal综合征，是一种发病多因性、临床表现多态性疾病，以长期无排卵和持续高雄激素为主要特征1。目前关于PCOS的发病机制学说众多，但确切病因仍不明确，且缺乏理想的 治疗 方法。西医主要有手术和药物等治疗方法，但由于手术创伤较大，而西药长期服用毒副作用较大，故临床应用受到肯定的限制。中医古籍并无PCOS这一病名，根据临床表现，应归属于月经后

11、期、闭经和不孕症等范畴，目前中医在治疗PCOS方面已显示肯定优势。补肾化瘀祛痰方（Bushen Huayu Qutan Recipe, BHQR）是临床 总结 的治疗PCOS的有效方剂2，本研究拟从血睾酮、胰岛素（insulin, INS）、卵巢局部调节因子抑制素（inhibin, INH）、胰岛素样生长因子?（insulin?like growth factor?, IGF?）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）着手进一步研究BHQR对其的影响。 1 材料与方法 1.1 实验动物32只3月龄雌性成年SD大鼠和8只3月龄雄性成年

12、SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（沪）2003?0003，由第二军医大学长海 医院 动物中心饲养。将32只雌性成年SD大鼠和8只雄性成年SD大鼠，按41合笼，交配后根据阴栓估计分娩日期，常规大鼠颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水，分娩8 d后选出雌性幼鼠105只供实验用，21 d断乳。25 恒温（50%湿度），清洁级饲养，不加饲维生素类制品。12 h光照（6:0018:00）和12 h黑暗（18:006:00）周期交替进行。1.2 药物与试剂丙酸睾丸酮注射液、中性茶油（上海通用药业股份有限公司，批号为050503）；BHQR（当归15 g，赤白芍各10 g，桑椹20 g，

13、枸杞子20 g，瓦楞子15 g，制首乌18 g，麦冬12 g等）由第二军医大学长海医院中药房提供，自制成浓度相当于含生药2.56 g/ml的溶液；大鼠胰岛素试剂盒（美国LINCO Research公司）；睾酮试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）；兔抗鼠IGF?多克隆抗体（Labvision?NeoMarkers公司）；兔抗鼠抑制素多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗鼠VEGF多克隆抗体（福州迈新生物技术开发公司）。1.3 BHQR水煎浓缩剂的制备取BHQR饮片置煎煮容器内，加相当于药材量57倍的冷水浸泡30 min，煮沸40 min，过滤。药渣加35倍量水连续煎煮，煮沸30 min

14、，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于生药量2.56 g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4 冰箱备用。1.4 动物模型制备按随机数字表法将105只9日龄雌性幼鼠分为病理模型组和溶媒对照组，其中90只病理模型组幼鼠于分组当日在颈背部皮下一次性注射丙酸睾丸酮注射液0.05 ml（l.25 mg），15只溶媒对照组大鼠于颈背部皮下一次性注射中性茶油0.05 ml。两组大鼠均于出生21 d后断乳，70日龄始通过光学显微镜观察阴道脱落细胞涂片，连续观察10 d，阴道上皮细胞持续角化，无周期性，无排卵，提示雄激素致不孕大鼠（androgen?sterilized rats, ASR）动物模型制备成功

15、。造模成功的大鼠进入后续实验，不典型的弃去不用。溶媒对照组大鼠70日龄后连续阴道脱落细胞涂片，呈现动情周期者取用。1.5 动物分组及处理30只病理模型大鼠按随机方法分为中药干预组和模型对照组，每组15只。80日龄起，按动物与人体表面积比换算法：人用药剂量（mg/kg）=0.16大鼠用药剂量（mg/kg），换算相应剂量，中药干预组按10 ml/kg体质量灌服BHQR（含生药2.56 g/ml）；模型对照组及溶媒对照组每天灌胃同容积蒸馏水。每日早、晚各1次，连续30 d。用药结束后，根据阴道涂片，恢复性周期者，于110日龄后第一个动情前期断头处死，无性周期者于113日龄断头处死。1.6 观察动情周

16、期大鼠灌胃20 d后，自99日龄至110日龄，每天作阴道涂片，将涂片行巴氏染色和脱落细胞学检查（以性周期规则出现为准）。依据大鼠性周期各阶段阴道涂片组织学特点，观察各组大鼠性周期变化情况来判断大鼠排卵情况。1.7 胰岛素释放实验及血睾酮检测晚8时禁食，次晨上午8时按3 g/kg体质量的葡萄糖剂量灌服50%葡萄糖溶液，灌糖0、0.5、1和2 h后眶静脉取血，将血静置2 h，离心（2 000 r/min）15 min，分离血清，置于80 冰箱，待测血INS。各工夫点血INS采用放射免疫法检测，药盒质量控制指标均符合要求，批内、批间变异系数均5.5%。大鼠乙醚吸入麻醉，抽取腹主动脉血4 ml左右，将

17、血静置2 h后，离心（2 000 r/min）15 min，分离血清，置于80 冰箱，待测血睾酮。血睾酮检测采用放射免疫方法，其操作严格按睾酮放射免疫分析药盒说明书进行。药盒质量控制指标均符合要求，批内变异系数5.4%7.4%、批间变异系数3.1%6.1%。1.8 卵巢INH、IGF?和VEGF免疫组织化学实验卵巢组织石蜡切片常规脱蜡至水；经0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波抗原修复15 min；加50 l 3% H2O2消退内源性过氧化氢酶，室温下孵育10 min，PBS洗3 min3次；加入50 l非免疫性动物血清，室温下孵育10 min；加50 l兔抗鼠抑制素或50 l兔抗鼠IGF?或50 l兔抗鼠VEGF，用PBS洗3 min5次；加50