酵母单杂交手册(translatedbymony)

1、酵母单杂交手册目录1 简介2 试剂盒包含的内容3 缩写4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息5 附加材料 & 酵母培养基A cDNA 扩增、文库构建和筛选所需的附加材料B 相应的培养基要求6 诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建A 方法：合成、克隆 p 目的基因 -AbAi 质粒B 方法：构建诱饵 -受体酵母菌株7 利用 AbAr 的表达检测诱饵菌株A 方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低 AbA 浓度8 cDNA 文库的构建A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链B 方法：利用 Long Distanee PCR （LD-PCR）增 cDNA 第一链C方法：利用 CHROMA SPIN+T

2、E-400 Colu mn技术纯化合成的双链 DNA9 单杂交的文库的构建和筛选A 方法：单杂交 cDNA 的文库的构建和筛选10 结果分析11阳性克隆检验和猎物（prey ）质粒分离A 方法：通过划板确认受体表型B方法：酵母菌落 PCR以消除Duplicate Clones （假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒D 方法：区分阳性克隆和假阳性克隆E分析阳性克隆的序列12 问题排除指南13 参考文献附录A:质粒信息附录B:酵母生长培养基的配置及所需营养物附录C: SMART技术原理图表图 1 利用 Matchmaker Gold One-Hybrid System

3、筛选蛋白 -DNA 的相互作用图2将相应的片段整合到 YIHGold菌株，构建诱饵受体菌株图3利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库图4通过菌落 PCR确认pBait-AbAi构建成功pGADT7-Rec图5利用SMART技术合成CDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到图6利用SMART技术进行扩增图7利用CHROMA SPIN+TE-40（技术并收集产物图 8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异图 9 通过共转化选择性培养基验证相互作用图10 pAbAi载体和做对照的 p53-AbAi载体图谱图11 pGADT7-Rec载体图谱图12 pGADT7载体图谱表

4、格表1 Y1HGold酵母菌株基因型表2利用各种SD培养基验证 Y1HGold酵母菌株的表型表 3 AbAr 本底表达的预期结果表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系表 5 Matchmaker Gold One-Hybrid 问题排除指南表6 Set 1酵母培养基和 Set 1 Plus酵母培养基的组分表 7 Matchmaker Gold Protocols 所包含的每一个内容1简介A介绍Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 为建立酵母单杂交 cDNA文库的建 立提供了一个简单高效的方法。Matchmaker G

5、old Systems具有AbA抗性因而具有很强的筛选能力，可极大地降低背景水平。这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析蛋白质与DNA之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。（图1）1 ScrPElng protrln- DNA InimfuctMirwr 啊*! ffee Mhrt"iak«r GcAd Onr-HyWdOw 宀和幻eIm Ci NA E*gn皿 rm>rter wetm wbE n 1ht*i ir 啣口跑 irw Itw 耳 I 戕u 舀 m>nu 冋ca ctme a In：IiwwAcijiv'J

6、iiiMi （H ilu/oA iMHEanc （AbA “X回贏 ei prQLftri fngni ifio-IWB Uii 4h*i bil'1图1.利用 Matchmaker Gold One-Hybrid System 筛选蛋白-DNA的相互作用将一至三个目的 DNA重复序列克隆至 pAbAi报告载体，然后整合到 Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告菌株。一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性（AbAr）基因的表达。酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌

7、E.coli内构建的文库。Matchmaker Gold System方法中的文库构建用到了SMART cDNA合成技术，只需从任意组织部位提取总量为100ng的RNA，即可使用该方法构建cDNA文库。B酵母单杂交的原理蛋白-DNA互作的一种实验方法诱饵（Bait） DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株（图 2）Lin»arU4 MM «ndinljc lhe lvsJ 型 ice us dl Vlb GelddnJl?LBWR

8、ftUft I,&WQW d* 列 hQmmlMQM rtwnmruHiQK iff押 tht MAQim cfVlffljiD M Rw mwlW 屮RY*iH(3OL dl -CcJJUDiilA Of Jir由drU-uEhJifc 亡1X -d tmf h“glL>|j5j r«Cim-hwUiEKsn wil'h 比 nrilijgpnw 寧占E if prvlidKl* 斡 rM pSit-AhAj rt<|>r WintrrKfmMra TYIKQMJ wllh I1pE.nrl - AhA. 阳Er I nepsdB宿El<W

9、宜i'WJU-Hs in C-Cl! S fh.7t grsw in tb-i tftwreriil tjm &&-UTI tirMwin 1 b«w wkrwiii riuv wr4l MUu AMl iwfiorur Ilu4 tan K uwJ>1 审 Hmtin DH*图2.通过同源重组将构建好的pBait-AbAi整合到 YIHGold菌株，构建诱饵受体菌株。ura3-52基因位于 YIHGold，常态下不活跃，造成不可逆的转座子中断现象，只有通过与野 生型中的URA3 gene同源重组才可以修复。而pBait-AbAi载体就包含 URA3ge

10、ne。当用BstBI或BbsI酶切表达载体后，pBait-AbAi载体呈线性化，用来转化Y1HGold,转化产物可以在SD/-Ura培养基（缺尿嘧啶）的培养基中生长，这些克隆中也包含稳定的Bait-AbAi，可以用来筛选蛋白-DNA之间的相互作用。C猎物（Prey）在Matchmaker酵母单杂交方法里，可能结合DNA的蛋白，或者说猎物蛋白， 被融合到含有酵母 GAL4转录激活结构域（GAL4 AD表达载体中进行表达，通过共转化SMARTPCR扩增的cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构 建好酵母中的猎物文库（图3）SMART 亡DNALibra

11、ry vectorIn vivo recombination in Y1 HGotdfBait yeastPlate on SD/ Leu.AbAMediumFigure 3- Ufff SMARTlitchnOlDgy pnd yeast biology tt> construct Screen your Jibrury Vi>ur cDNA litjrary $ jirrujlwnf- QuSlyanddirectily inFirst, SMART tDhlA.tdhrioloy 灯曲伯& 我 tDNA pool withriankmg笛u芒詐m台 that 古魁 h

12、omiCilogout to Lh底 pr<ay vettoL pGADT7-Rec. When the 亡DNA and £卜白 ilinar ：pGADT7-RecVeetor are eottanifGffmd your mwI# crewed YIHGQldlBsilithe y的就 fSMfYitoine 出酉 cDN Aihdthe vector with htgh effictencv.Tr±1 rrsform-ad cells are plated ora SD/-Lem-+ALAto select forcoloms whose prey prole

13、ins have adivalDd (he AbAp reporter.图3利用SMART技术和酵母的生物学特性，在酵母中同时构建和筛选文库。在酵母中同时构建和筛选cDNA文库。首先，利用SMART技术构建cDNA文库，这些cDNA文库的序列末端与线性化的猎物载体pGADT7-Rec末端具有同源序列。将 cDNA文库和pGADT7-Rec共转化到Y1HGold-Bait报告菌株中，在酵母中进行同 源重组。将酵母细胞涂布于 SD/-Leu/+AbA 培养板上，以筛选表达报告基因的阳性的Y1H相互作用。探寻蛋白-DNA的相互作用一一Aureobasidin A （AbA） 是一种环酯肽抗生素，在低

14、浓度 （0.1-0.5 礸/ml）下即可对 酵母产生毒性。包含 AbAr gene（ AUR1-C突变基因）的转化酵母菌株pBait-AbAi可以获得抗生素抗性。当猎物蛋白（Prey ）结合到诱饵序列（Bait），GAL4 AD就会激活 AbAr的表达，从而能够在含有抗生素 AbA的培养基上生长（图 1 ）。Matchmaker Gold One-hybrid技术可被用于：鉴定新的蛋白-DNA的互作验证已知或可疑的蛋白-DNA的互作明确存在互作的蛋白结构域和同源的DNA序列 方法总述：（包含以下步骤）第一步：将目的基因（ bait ）克隆到 pAbAi 载体上 第二步：将构建好的 pBait-

15、AbAi 质粒转化到 Y1HGold 酵母菌株中（图 2） 第三步：测试 Y1HGold bait 菌株的 AbA r 背景表达水平 第四步：通过共转化和体内同源重组构建和筛选 cDNA 文库（图 3 ） 第五步：确认和解释筛选结果ATTENTION: Successful use of any yeast one-hybrid system depends upon no/low recognition of your target sequence by endogenous yeast transcription factors, which can cause high backgro

16、und expression of the reporter gene. For this reason it is critical to test your Y1HGold Bait-AbAi strain forrAbA expression （AbA resistance） before screening a library （see Section 6）. 注意！酵母单杂交系统是否可靠取决于内源酵母转录因子不识别/几乎不识别你的目的片段，如果能识别该目的片段将造成报告基因很高的背景表达。因此，在进行文库筛选前要严格测试酵母菌株 Y1HGold Bait-AbAi AbA r 的表达

17、（可产生 AbA 抗性）2试剂盒包含的内容The Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System (Cat. No. 630491)包含的材料可以构建5个酵母单杂交文库，推荐使用 Advantage? 2 PCR Kit (Cat. Nos. 639206 & 639207)试剂盒扩增SMART cDNA 来获得双链 DNA ( ds cDNA)Bax 1 Store JL -2(FC;pl SAI ART MMIV RT 口 IHi iviiUblc u Cir Mu.Bofl 4: LU pl iMkT 11I O

18、lipqniuLmtiJc 112 y(Jn nr iI。M CDS Id rtimcr tli10 M C .OS IL L. h Pruner i 10 ubLj九 pl CanmJ fttly A' R.MAi Mnusf I jwt; 1 卩耳 pLkBox 5at RTJ:汕 p- $ 1*1 H JMiiict |ll |M1軸 M i' FCR Primer 14 甬lif pil RKufH (Z u cii t£j' pl j斗00 pl XldTtnj ScUuii<in网 山 dNTP Mix (KI mM ciA dX【H*ima

19、l 'lini'inuetl；勺X) n 1 u l>oiiich YPPA- Bradh I U.S Id* ) p-otiLh PDA viith Agr (0.5 L)* 1pouch SR" Ltj wixti Apar I 0,51.1* SUndNX J Scihjicuib (!?>%* 71JOplSodwiim 為cELaw I 5 Ml气INI pl Drnnuird H.O* IU»匸H KLIMA. SPIN、EVI匸©EunuvOther曲 Linld OtiE-HylstiJ Lifmry Sle«

20、nitigSystem Uxt AiLaiiujil I Pl 4*UA IJBax ZlStcre m-20*CJ:Hiker" ¥c»st TranJnrTTKtkin Siincm 2*1D01 ) of!)* 丄 i 1 mt VL'Asmiur L jnvr UISA- dtrniEim'd斗0 fjj/nil)* 抽卩】pGFTLJ 11 1 pp'fjl;詐wirml pUtinuliBox 3 S-tore «t ffT)：¥ea<l iuk«rYujt rjJi«Ji>n

21、n3.Einn S-xtem 2*Box 2* 2 1 $(J ml PE(. SO ml 1 M l.LAc (1GX4$0 ml 10XTE BuHir $U ml ¥Pl> tu Liquid、In£ium">Va JhlrdX Clt. +也 命64 占ciisirnakcr cwTraJMfarmarixwi Sywrcni 2 LscrMama I'PTl PS I)1-pt鼻U】二吐 *ctix【nEonruts (P厂界划5) Hat IMmizi阴 I PT+D'M * pGADT? AD Veanr【vthrnui：

22、icw (FT Qiw W ：i3缩写Al'libur/ plasmidFlmid sncthding 2 t'uiion of nhe CiALj jcti vat inn dcDimj library jDXA; alsj，prev plismid0.ADliburx pruidiLA Au tom pioidri compfiwd of the GAL4 activtkin donuln and i pulyprpiiJe crioxled by r library eDNA;so prev piDitrin，T.AD A rttcjPlatnid tnciKjing r

23、he yeist Ci AL Iilctruin, t.g. ptiADT" Rec “RjtipAbAl conuiniii(inf “r nuxe repeat nf <(nir urrt DNArikrwf 111 rr«cPreyA GAI.4 AD fujifto prorein espmsed from xht pliADl-Rcc v«(cr which ccnrain; 3 library cDNAY&ast PhenotypesUrj-n lu-> nr Tip亠Strairts ilirft rctjLLirr 11 idt

24、il (Cu., Icutliic (Iju), ur 灯片皿耳丄丄it ll rpi, rr>|K-itivrlyn in iLc iurdiuni u 昌】u. die< iit iLLumcph.iL lur onr di inorI ui ihcsriiulriciiLS.Miscellaneous5DMiniimJ. nrbtricillv defined mediunn for yeast； is comprised of a nirroen bjse. 2 carbon source (gjucotse unle smtd 0由eiwise)> nd a DO

25、suppkmenrTX1Diopow (supplcmem or nluloH mixrurr nf specific amino xiifc and nudeodfaUXtl I<1 supplfnnil SD bir lei nukr SD nn-d in fll; DO vJutinri :nt rniviin <irXr i*r iron of the nutriaits r«quiisl bj untraiifunnedto grow on SD mEiiuinYPPA blend of yeiw exrrjcc. pcpione, n<l dexircs

26、e in oprimd propon io nt for growih of nnins of XYPDAYPD mcxunni Mipplcmrnrcd with adrninc hcmimlGrr (120concentrednn) tnpic ven ycdsi tulLic?> fnni txx“miL 隔 picik in4 Y1H Gold酵母菌株的相关信息表1是Y1H Gold酵母菌株的基因型，表 2是在不同SD (营养缺陷型)培养基上的表型。若想了解更多关于酵母生长和繁殖的信息，请查阅Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology

27、 (Guthrie & Fink, 1991)Table I; YIHGold Strain GenotypeStrainGenotypeYIHGoldMATcithis3-2Q0t ad-10rt trpf-90T, le2-3t112,辭血 g謝沁 mer- MELITable II: YIHGold Phenotypelasting on Various SD MediaStrainYIHGoldSD/-LeuSDAUraSD/AbA2*0YIHGold 5-AbBl1Y1HGold；pGADT7-Rec-p531¥1 HGolcipGADT7-+1R&c-|6

28、3/p 5 3-AbAiJ5附加材料&酵母培养基A cDNA扩增、文库构建、文库筛选所需材料进行PCR时DNA聚合酶的稳定性。推荐使用the Matchmaker Gold kit 扩增SMART 单链cDNA ,并以此 为模板，用 Advantage 2 PCR Kit (Cat Nos. 639206 & 639207) 扩增 ds DNA。利用 Advantage 2 聚合 酶混合物扩增 cDNA(as large as 20 kb)比常规 PCR 具有更高的保真性。Matchmaker Gold YeastOne-Hybrid Library Screening Sys

29、tem 不包含 Advantage 2 PCR Kit 。限制性内切酶 BstBI或Bbsl，可使pBait-AbAi质粒线性化，帮助其更好的转化并整合到Y1H-Gold中。Alitchmaker Insert Check PCRMix 1Xu.Ihiii LcmrlerTc 2X mix gntjjn、PC.RItM tunLkIILing lIiii >liui pBiiit-AbA into the YlHCiold genome.dNTL, ud butCLi lui pei：uiitiijigour tnrpet sc-ueticc Jusi(酵母菌落PCR确认pBait-Ab

30、Ai质粒已整合到 Y1H-Gold基因组中，用rTaq即可)Maichmaker Insert Check I*CR Mil 2 (C'al Nd. 63049H，ur Malchmaker AD LIXn&ert ScreeningAmplimer See K.it. No. 650433) tor dmpliR'ing Jiiti. chiriccurizitig the cDNA inserii from the libriy tlut jre contdincJ in the poitivc cLdjici thit emetpj litini vour scu

31、cEng.Euy FLmnid Lviatiun Kii (Cj. Nu. 63046), Ilk bitnplu diitl ciliLjni eoljc ul libjdiy pLi'inLkL fj(jjliJThermal cycles for aligonudcoLid aiuiedjng diid 匚DNA jriplihcation. preit!riL>Ap 旳Lumped 'Ji：h a hejlixl lid. (PCR 仪) 其他实验室常规试剂、酶以及质粒构建、扩增、鉴定等所需试剂。详见individual protocols for require

32、mentsB酵母培养基及所需营养成分Yeast Mediji S«t L «'jf. Nc. 63()492) and'nr Yeast Media Set 1 Plus «lat. Nci.仍049引.Th火 nedia sett liKh canciin i complerc assonimm: r vcady-nibccd foil pouches fur preparin昌 tlic Eve specialized brenh and 唱H media needed feir the Much maker CtoU Veisi One-Hy

33、biid、:The ¥eut Media Set I Plus ihof-HK.iirs Xur：-ii-,iciT | (Ser Appendix B).(详见附录B)Aunenbjfidin A ('.；t. Niw. (S3(i46(i &st e Apjvrbdix R for ttnek uilnnon prepararinn iruirructituis, rindfor il、UM in nvzdii prcpdiation.(AbA，已买，具体介绍、使用说明等见附录B)AddiLiunaJ yr<ut niediiL Appendix B 血*

34、infLiLULiiJuii Ilji pmclujc jilg j/iupaj nion fuj .况h uf lilt rcquiicd rnrdiil limes which ire avaihblt3 as Ifeast Media Pouches m rxick'i of <!.酵母培养基(附录B有每一个组分购买、配制等详细介绍说明)YPDA是用于培养所有 S. cerevisiae酵母菌株的一种常规的丰富培养基。附加的腺嘌吟(adenine )可阻止酵母因继代培养代数过多而变成粉红色。SD 培养基 （synthetically defined medium） 是用于

35、S. cerevisiae 酵母菌株培养和质粒转化鉴定的一种 minimal media 。SD base培养基包含了一个酵母细胞生长所需的所有最基本的东西，包括碳源和氮源。而 各种重要的氨基酸分别加到 SD base 培养基中就形成了 minimal media 。 Clontech 'sYeast Media Pouches 已经包含了预先混合好的各组分。 根据转化质粒的抗性标记基因选择不同的 minimal medium 以 供含有转化质粒的酵母菌株生长。SD/-Ura DO supplement （缺乏尿嘧啶的 SD 培养基内容物）用于鉴定 bait-reporter 是否构建

36、整合到 YIHGold 菌株中。 SD/-Ura DO supplement 中包含了酵母生长所需要的所有营养物质， 除开尿嘧啶 （这是 公司规模化生产的一种商品， DO 就是 dropped out 的意思）。因为 pAbAi 质粒编码一个 URA3 基因，其 产物就是尿嘧啶。因而整合了该质粒的酵母菌株可以在缺乏尿嘧啶的培养基中生长，而普通的酵母细胞中 该基因处于抑制状态，不能自己合成尿嘧啶，则不能在这种缺陷型培养基上生长。SD/-Ura/AbA* 培养基。若 prey proteins 与 bait sequence 之间存在相互作用，就会产生 Aureobasidin A 抗性，用于筛选

37、的 AbA 的浓度要根据每个酵母菌株的不同采用滴定法进行确定。6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建在开始实验前请仔细阅读该说明书，克隆目标基因详见方法A。获得Ylhgold target reporterbait strain详见方法 B。A. 方法：构建 pBait-AbAi质粒pBait-AbAi质粒必须包含至少一个目的DNA拷贝，插入到 pAbAi载体AbAr受体基因的上游，（具体说明见Target Sequence Notes）。许多研究表明高效的质粒包含三个目的基因的串联拷贝，但是在有些情况下 单拷贝也能满足条件。有多种方法可以获得串联拷贝，其中利用寡核苷酸合成（引物合成）是最为方面可 靠

38、的办法，尤其是合成<20 bp的常规片段。TARGET SEQUENCE NOTES; The anncaledoligaficonsistaf arTccrmotocopicsof tho torgot olomont and should bo dosigred with a diff«rnnt rastriction site ovartiang an each and Wh 厳 n the two sr rands are annual Rd. ttie re- uliinq double-stranded DNA will have d diFereni overHa

39、ng at each end for directional cloninq into the appropriately digested pAbAiVector We recommend that you also create a pAbAi canstruet containing a rlque nc j having pointmu!atiDnsto disrupt protein birding, tr as acontrt>l in CTonfirming thespecifk;ity uf your posiLivti duns in peciiji i X If a

40、clonet： prutui i is known to inuencer you may wish lo|.lionrr if into the supplied tsGAT7 vrtcit for use as a i s cc-ntrol for your bait sequerce（设计引物时两端酶切位点应不同mutant bait 载体作为负对照，方法见 Section 10若有已知的与目的序列互作的蛋白，可将其整合到pGADT7 vector 作为正对照）1. 针对不同的目的DNA序列，设计两个反向平行的引物，该引物对必须包含 pAbAi载体上的酶切位点，以产生粘性末端。强烈建议当

41、5'-end选择MCS中Smal上游的多克隆位点做为酶切位点时（比如Sacl ），3'-end选择SalI或Xhol作为酶切位点。建议同时构建一个 mutant bait载体，这个载体包含一段可以 抑制bait结合文库蛋白的目的 DNA序列（RNAi ?）2. 合成的引物在PCR程序过程中，退火之后，引物可以结合到pAbAi载体上。引物在-20° C保存。a. 溶解引物至终浓度为100 gM的母液b. 按照1:1比例混合上游引物和下游引物，至终浓度为50 M （假设100% theoretical annealing）c. 将混合后的溶液在 95°C处理30

42、s，使所有二级结构解聚d. 72°C 加热 2 mine. 37° C 加热 2 minf. 25 C 加热 2 ming. 置于冰上3. 线性化1 ug pAbAi载体。用限制性内切酶酶切 pAbAi载体，使其带有粘性末端（详见Section 6 A.1 ）。 跑琼脂糖凝胶电泳，分离线性化的载体，再切胶回收纯化该片段。4. 连接线性化的 pAbAi Vector 和 ds oligonucleotidea. 将（2g.冰上保存的）引物浓度稀释到0.5 gM注意：为了达到较高的连接效率，引物一定要进行稀释，若引物浓度太高会降低连接效率。反应体系：（按照相应比例换成10uL体

43、系）1.0 pl1.0 pl口的片段pAhAi Trrtor (5ft1i ncuriicd and whhnrrhangs 具石粘性末端的pAbAiAnnriJrd oligonudeotide <0.5 pAI) (jigLit or mutjilt 哇15 pl IDX 14 DNA livcr buHrO.S pl BSA(10mg/m)10.5 rI NuckaM fr« H,U <|ddH2O 杓 f*0.5 pl T4DNAlipue <44M)U；|ilI > pl Ictal volume注意：如想做对照，可用 1uL ddH20 替代目的片

44、段Note: If desired, a control ligation can be assemble d using 1 卩 l of nucleasfree H2O instead of annealed oligonucleotide.b. 反应混合液置于室温 3h ,转化大肠杆菌E. coli ,菌落PCR鉴定阳性菌落，挑阳性菌落，摇菌扩繁, 提质粒，酶切鉴定载体是否构建成功。B.方法：获得 Bait-Reporter Yeast Strains将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold菌株中包含以下步骤(示意图见Figure 2)：第一步：用限制性内切酶 BstBI或

45、Bbsl酶切pBait-AbAi， pMutant-AbAi (阴性对照，确定有相互作用后再构建)，和p53-AbAi (阳性对照，一定与 AD存在互作)质粒，使其线性化。第二步：将线性化的质粒转入Y1HGold菌株，用SD/-Ura培养基进行筛选。第三步：菌落PCR鉴定阳性菌落，消除假阳性。pMutant-AbAi 和p53-AbAi如何鉴定？ Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)？第四步：摸索确定抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度。强烈建议按照以下方法将线性化的p53-AbAi转入酵母做为阳性对照(正对照)，构建pMutant

46、-AbAi作为阴性对照(负对照)。所需材料：Y1HGold yeast strainp53-AbAi质粒以及根据方法 A构建的pBait-AbAi 质粒和pMutant-AbAi 质粒限制性内切酶BstBI或BbsI去 DNA 试剂盒 DNA clean-up kit (e.g. NucleoSpin Extract II, Cat. No. 740609.50)Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (included)Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)SD base+ DO Sup

47、plement-Ura 固体培养基 (SD/-Ura with Agar )YPDA液体培养基(可采用 YPD代替YPDA)1. 用限制性内切酶BstBI |或 BbsI 同时酶切 2ug pBait-AbAi ，pMutant-AbAi 和 p53-AbAi，将载体上的URA3基因打断，载体线性化。酶切后，电泳分离片段，切下目的片段，用试剂盒回收纯化。 可用NucleoSpin Extract II (Cat. No. 740609.50)试剂盒，本实验室用普通胶回收试剂盒。2. 用 Yeastmaker Yeast Transformation System 2( PT1172-1 )里面

48、提到的方法，将线性化的1ug质粒转到Y1HGold中3. 将转化后的菌液分别稀释 10倍，100倍，1000倍，吸取100 uL稀释后菌液到 SD/-Ura固体培养基上。培养三天后，挑取 5个单菌落，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 做菌 落PCR确定阳性菌落(原理见图 4)。用未转化的Y1HGold菌株做负对照。Figure 4L Contirming pBaiit AbAi integrstion by colony PCFL I he primers n tlhe Matchmaker nssrt Check PCR Ml lx 1 sre iGca

49、tesd in I he AIjA" gene and in theYlHold y eno me, dtawnstreairh of lhe UHA3 locus. They will amplify a reg iun of -*14 kb thatour bait 帥甲用曲 and CGflfinns t.h« p他盂柑时盅。of tha intcgratod phgm d S&& Figure 2 fair conlAxt图 4.用菌落 PCR 验证 pBait-AbAi 整合到 YIHGold 中。Matchmaker Insert Check P

50、CR Mix 1 中的引物位于Y1HGold基因组中的AbAr基因上，处于URA3基因的下游。如果质粒成功整合到Y1HGold中，利用这对引物可以扩增出一段包含bait序列的约1.4kb+X的片段。联系图2更便于理解。预期的PCR结果分析：正对照：1.4kb负对照：没有条带包含目的片段的菌株：1.35 kb + Insert size ( 1.5kb)4. 确认为阳性菌株的各挑一个单菌落，以及正对照p53-AbAi control上的一个菌落，挑菌在SD/-Ura培养基上划线，30C倒置培养平板3天，在4C至少保存1个月，既构建好Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi cont

51、rol strain 。5. 挑菌在YPDA (3 ml)液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，加1mL freezing medium (AppendixB)重悬菌体。在液氮中速冻后，可在- 70 C长期保存。Note: The integrated plasrnKis are werv stable, oernighl broth media cultunng without U/MJ selection 別ill not rtfbult in Iq静甘 uf ttie iiiteyrdnl.注意：完整的质粒是非常稳定的，即使在没有URA3选择压力的液体培养基上过夜培养，也不会导致质粒部分结

52、构丢失。6. 利用AbAr的表达检测诱饵菌株A. 方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度如果bait sequence 整合到pAbAi载体中，在没有猎物蛋白(prey)的诱饵报告菌株(bait reporter stain ) 中的本底表达水平是不稳定的。例如，抑制p53-AbAi control生长的的最低 Aureobasidin A浓度是100ng/ml。注意：任何酵母单杂交实验成功的关键取决于酵母内源转录因子对你的目的片段不识别/几乎不识别。因此，在筛选文库(或验证相互作用)前要用AbAr expression严格测试构建好的 诱饵菌株。以下的实验方法 可以帮你确定在文库筛选过程

53、中抑制bait con struct本底表达的AbA浓度。所需材料：利用第 6 部分 B 方法得到的 Y1HGoldBait/AbAi strain，Y1HMutant/AbAi strain 和 Y1HGoldp53/AbAi control strainSD/-Ura培养基Aureobasidin A (AbA)包含 100 -200 ng/ml AbA 的 SD/-Ura/AbA 培养基方法：1. 从bait和control strains中挑选较大的菌落，用适量0.9% NaCl重悬菌液，调至OD6000.002 (即大约每100uL包含2000个细胞)2. 分别在 SD/-Ura，S

54、D/-Ura with AbA (100 ng/ml) ，SD/-Ura with AbA (150 ng/ml) 和 SD/-Ura with AbA (200 ng/ml)培养基中各点100uL，30 C倒置培养 2-3d3. 预期结果见表3Table Illi: Expected Results for AbA* Basal ExpressionAbA ng/ml¥1HGold(p53-AbAi coloniesY1HGoldpBait-AbAi colonies0-2000-20001000Bait dependent1500Bait dependent2000Bait de

55、pendent注意：如果200 ng/ml的AbA也不能抑制本底表达，可以尝试将 AbA浓度加大到500-1000 ng/ml。但是 如果在没有prey的情况下，1000 ng/ml也不能抑制AbAr基因的表达的话，你的 bait DNA sequence 极有 可能被酵母内源转录因子识别，那么你的这段序列就不能用于酵母单杂交的筛选试验。4.筛选文库时，用抑制 bait strain生长最低的AbA浓度，或者用比最低浓度高50 -00 ng/ml的能完全抑制生长的AbA浓度。8 cDNA文库的构建VIII. Generating cDNA for Library Construction（本实

56、验不需要，此部分未翻译）包含表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系图5利用SMART技术合成 cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec图6利用SMART技术得到高纯度的 cDNA文库图7利用CHROMA SPIN+TE-40Q技术并收集产物(J OI19O MT binds to RNA templateTerminal Iranfersse ActivitY adds dCTP： SMART o-ligo snn«als to CGC overhTable IV Relationship Between Amount of RNA and Optimal

57、 N umber of Thermal Cyclestotal RNA (pg)PolvA+ RNA (pglMember of Cvcles10-2.0D.5t015-2D0,510C.25-0.520-220.55-0.50.125-0.2522-240.05-0,250.025-0 J 2524-26Tamplate Switching incor SMART oligo, raautting in knownsequences al both ends of ah cDNA£*Figure 5. SMAHT cDNA syriith tsisno rates cDNA ends that are homologous to ths don i ng site In pGADT7-Rnc.2MFigure 6. High-quality cDNAusing SMART cDNA 詁rntho商匚 01 igo dTyrimed cDNA 酬Mh侧用辭 cniod oulwith or without 1 pg of mous« liv&r poly A- RNA Iposdive nd mgativa controls, ruspecLivolv)- LD PCR Wdig porformed using The Actvi