强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

1、强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响        【摘要】     ：目的 观察强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法 使用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,5-溴脱氧嘧啶(Brdu)和CD44、CD54双重免疫组化鉴定,传3代后的MSCs分为强肌健力口服液含药血清组和空白血清对照组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测2组MSCs的生长情况。结果 强肌健力口服液含药血清组以浓度依赖方式促进MSCs的增殖活力,与

2、相应浓度的空白血清对照组比较差异有显著性意义(P<0.05, P<0.01)。结论 补脾法(强肌健力口服液含药血清)能促进干细胞的生长。     【关键词】  补脾法强肌健力口服液骨髓间充质干细胞含药血清    Effects of Serum Containing Qiangjijianli Oral Liquid on In-Vitro Proliferation of Rat Mesenchymal Stem Cells CHEN Kai-jia, LIU Xiao-bin,

3、QIU Shi-jun, et alGuangzhou University of TCM, Guangzhou 510006, ChinaAbstract：Objective To observe the effect of serum containing Qiangjijianli oral liquid in-vitro proliferation of rat mesenchymal stem cells (MSCs). Methods Rat mesenchymal stem cells dissociated from the bone marrow by density gra

4、dient method were cultured. MSCs were identified by marking of bromodeoxyuridine (Brdu) and staining of CD44, CD45. Experimental group was cultivated with serum containing Qiangjijianli oral liquid and control group with blank serum. Optical absorption value of MSCs was stained by methyl thiazolyl t

5、etrazolium (MTT). Results Serum containing Qiangjijianli oral liquid at different concentrations could promote the proliferation of MSCs, the difference being significant in comparison with the control group (P<0.01). Conclusion Invigorating the spleen (serum containing Qiangjijianli oral liquid)

6、 can enhance the proliferation of MSCs.Key words：invigorating the spleen；Qiangjijianli oral liquid；mesenchymal stem cells；serum containing drug    骨髓间充质干细胞(MSCs)是干细胞中的一种,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点,并能在一定的诱导条件下向成骨细胞、成肌细胞等中胚层细胞分化,其应用前景极其广阔。本研究在邓铁涛教授“脾肾相关”的理论指导

7、下,探讨补脾法(强肌健力口服液含药血清)对大鼠MSCs增殖的影响。1  材料与方法1.1  动物    纯种SD大鼠,SPF级,4周龄,体重90130 g,用于MSCs细胞的提取；纯种SD大鼠,SPF级,成年,体重180220 g,用于含药血清的制备,由广州中医药大学实验动物中心提供,许可证号：粤鉴证字2005A031SCXK(粤)2003-0001。1.2  主要试剂    IMDM培养基、特级胎牛血清、胎牛血清(FBS)：美国GIBCOL公司产品；链霉亲和素生物素复合物(SABC)、二氨基联苯胺(DA

8、B)染色试剂盒、抗体CD44、抗体CD54、增殖细胞核抗原(PCNA)、生物素化二抗(羊抗小鼠)、AEC显色剂、BCTP/NBT显色剂：武汉博士德公司；四甲基偶氮唑蓝(噻唑蓝,MTT)、5-溴脱氧嘧啶(Brdu)及其单克隆小鼠抗体：美国Sigma公司；D-Hanks液、TBS、PBS、2%台盼蓝染液、0.25%胰酶、马血清：广州威佳公司提供。1.3  强肌健力口服液含药血清的制备    强肌健力口服液(黄芪、党参、白术、当归、甘草等)由广州中医药大学新药开发中心提供,批号20040701,临床批件号2003L00874,含原药材1 204 g/L。采用成

9、年SPF级SD大鼠,分为实验组、对照组,每组5只。实验组每日给予强肌健力口服液灌胃,灌胃剂量以50 kg体重成人的常规用量,按大鼠体重转换系数计算,含原药材36.12 g/kg,连灌1周。对照组则给予等体积蒸馏水灌胃,连灌1周。最后1次灌胃后2 h,无菌条件下开胸取血,静置34 h,离心分离血清,取上清液,56 水浴灭活30 min,-20 保存,制备强肌健力口服液含药血清和空白对照血清。1.4  骨髓间充质干细胞的分离及体外扩增    取4周龄SPF级SD大鼠4只,10%水合氯醛腹腔麻醉注射。无菌条件下取双股骨及胫骨,收集骨髓腔内组织细胞。将细胞悬液分

10、装,2 000 r/min离心20 min,密度梯度离心2次,收取单核细胞层,加入IMDM培养液,打散成细胞悬液。细胞悬液用2%台盼蓝染液染色,计数300个细胞,调整密度,染成蓝色的死细胞小于5%方可继续实验,计数板计数,按1×104个/瓶密度接种于(7×5)cm2培养瓶中,置于37 、5%饱和湿度的CO2培养箱中培养,2 d后半量更换培养液,弃去未贴壁细胞。以后每3 d换液1次。细胞培养710 d后细胞密度较高,达90%融合后弃去培养液,加入D-Hanks缓冲液进行冲洗,0.25%的胰蛋白酶37 条件下消化510 min,镜下观察消化控制时间。当细胞形态开始变圆、漂浮、脱

11、壁,立即加入血清终止消化反应。常规按12或13比例传代。1.5  骨髓间充质干细胞双标免疫组化检测    传3代后的细胞种入装有IMDM空白培养基的24孔板中,24 h后固定；0.01 mol/L TBS洗2次(10 min,5 min),3% H2O2洗涤10 min,蒸馏水洗2 min×3次；正常山羊血清封闭20 min,甩去多余液体,一抗用多克隆兔抗,CD44、CD54(1100)4 过夜(对照组不加一抗,加TBS),0.01 mol/L TBS洗2 min×3次,生物素化羊抗兔37 40 min,TBS洗2 min×

12、3,SABC-AP 37 40 min,TBS洗5 min×4次,BCTP/NBT显色30 min,双蒸水洗2 min×3次。双标阻断液30 min,0.01 MTBS洗2 min×3次,正常山羊血清封闭20 min,一抗用Brdu(小鼠单克隆抗体)1100于37 3 h(对照组不加一抗),0.01 mol/LTBS洗2 min×3次,生物素化羊抗小鼠IgG 37 40 min,0.01 mol/L PBS洗2 min×3次,SABC试剂37 40 min,0.01 mol/L TBS洗5 min×3次,DAB显色3040 min。中

13、性树胶封片。1.6  MTT法细胞活性检测     制备单细胞悬液,计数,调整细胞浓度为1×105/mL,接种于96孔板,1×103个细胞/孔,每孔容量200 L,实验组分别含强肌健力口服液含药血清5、25、50、75、100 L/mL,对照组分别含空白血清5、25、50、75、100 L/mL。各组同时培养达72 h后每孔加入MTT(5 mg/mL)20 L,继续在37 培养箱内孵育4 h,去上清,然后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 L,振摇10 min,用PE-1420多功能微板分析仪于490 nm波长处测光吸收值

14、(OD),以绘制增殖曲线。1.7  统计学方法    所得数据用SPSS 11.5软件进行统计,结果用x±s表示,用t检验和方差分析确定差异显著性。2  结果2.1  骨髓间充质干细胞扩增传代后观察    传3代后的MSCs细胞,在实验组与对照组中均可生长,在空白血清培养基中生长较缓慢(见图1),而在强肌健力口服液含药血清中细胞生长迅速,形成克隆球(见图2)。2.2  骨髓间充质干细胞双标免疫组化检测结果    镜下可见,未使用CD44、CD54、Brdu

15、标记的细胞未被染色,镜下为透明的细胞(见图3),用CD44、CD54单标并经BCTP/NBT染色,再经Brdu双标DAB复染后的MSCs细胞表面被染成蓝色,细胞核被染成棕黄色,表达率达96%以上(见图4),表明培养的确是MSCs细胞。2.3  强肌健力口服液含药血清对骨髓间充质干细胞增殖的影响(见表1) 表1  强肌健力口服液含药血清与空白血清组MTT比较(x±s,OD)浓度(略)注：与相应浓度空白血清组比较,*P<0.05,*P<0.013  讨论3.1  骨髓间充质干细胞的培养和鉴定    本实验利

16、用密度梯度离心将大部分的造血细胞和MSCs分离开来,再经过多次体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血细胞,经严格控制胰蛋白酶的量和消化时间,利用MSCs较易脱落的特点,保证MSCs在短暂的作用时间内与培养瓶分开,淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养瓶,从而使MSCs得到纯化。免疫细胞双标化学染色结果显示,所培养的细胞表达CD44和CD54(见图4),他们都是MSCs的重要标志物,Brdu是一种胸腺嘧啶类似物,利用Brdu标记技术可以观察MSCs细胞的分裂增殖情况,所培养的细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%以上,表明所培养的是具有分裂和增殖能力的MSCs。3.2 

17、; 强肌健力口服液含药血清对骨髓间充质干细胞的增殖作用    强肌健力口服液是根据邓铁涛教授临证经验研制的治疗痿证的方药,该方取“治痿独取阳明”之意,在补中益气汤基础上,重用黄芪为君,占46.5%,辅以党参、当归、白术、甘草等,具有补脾益损的功效1。本实验采用MTT法测量细胞生长曲线,其原理是活细胞中琥珀酸脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝色产物,而死细胞没有这种功能。再用DMSO将蓝色沉淀溶解,用多功能微板分析仪检测光吸收值,因此,MTT光吸收值(OD)反映了活细胞数量多少,也反映了MSCs的增殖能力。结果表明,强肌健力口服液含药血清对MSCs的增殖作用与浓度呈明显量效依赖关系,在浓度达75100 L/mL时,可以对MSCs的增殖产生明显的作用,与空白对照血清比较,具有显著性差异。表明增殖是强肌健力口服液药物作用的效果。    MSCs存在于骨髓中。从中医学而言,生理上,骨髓与脑同属奇恒之府,与肾有密切关系,肾合骨、生髓、通脑,均同出于一源,二者来源于先天的肾之精气,为后天水谷精气所化生；病理上,若肾精不足,不能生髓充脑,可导致脑海不足诸症,故临床上见到骨与脑、脊髓的病变,常从肾着手治疗。中医理论也认为,脾主肌肉,为“后天之本”,气血生化之源。脾(胃)与肾关系极其密切,二者生理上相互滋生、相互为用,即“先