分析化学 色谱联用分析法课件

1、第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法 色谱联色谱联用分析法用分析法 两种色谱联两种色谱联用（色谱用（色谱- -色色谱）分析法谱）分析法 色谱与质谱、色谱与质谱、波谱联用的波谱联用的分析方法分析方法 提高提高 分离分离能力能力 提高提高 定性定性能力能力第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法 将分离能力很强的色谱仪与定性、定结构能力将分离能力很强的色谱仪与定性、定结构能力很强的质谱或光谱仪器通过适当的接口很强的质谱或光谱仪器通过适当的接口(interface)(interface)相结合成完整的分析仪器，借助计算机技术进

2、行物相结合成完整的分析仪器，借助计算机技术进行物质分析的方法。质分析的方法。 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法 主要包括主要包括气相色谱质谱联用气相色谱质谱联用 GC-MSGC-MS高效液相色谱质谱联用高效液相色谱质谱联用 HPLC-MSHPLC-MS毛细管电泳质谱联用毛细管电泳质谱联用 CE-MSCE-MS第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法一、气相色谱质谱联用一、气相色谱质谱联用 （一）原理（一）原理 由于由于GCGC的试样呈气态，流动相也是气体，的试样呈气态，流动相也是气体，与质谱仪的进样要求相匹配，故最容易将这两与质谱仪的进样要求相匹配，故最容易将这两种

3、仪器联用。种仪器联用。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法分离试样中各组分，起着样品分离试样中各组分，起着样品制备的作用制备的作用 气相色谱仪气相色谱仪接口接口 起着气相色谱和质谱之间适配起着气相色谱和质谱之间适配器的作用器的作用 质谱仪质谱仪 气相色谱仪的检测器气相色谱仪的检测器 计算机系统计算机系统 获得色谱和质谱数据，进行数获得色谱和质谱数据，进行数据采集和处理据采集和处理第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（二）气相色谱质谱联用仪器（二）气相色谱质谱联用仪器 主要由主要由色谱单元色谱单元、质谱单元质谱单元和和接口接口三大部分组成三大部分组成接口装置的作用接口

4、装置的作用 将色谱与质谱联接起来，以除去载气、将色谱与质谱联接起来，以除去载气、 降低气相色谱仪柱后流出物的气压，同时降低气相色谱仪柱后流出物的气压，同时对试样起富集的作用，并把组分送到质谱对试样起富集的作用，并把组分送到质谱仪的离子源。仪的离子源。1接口接口(interface) (interface) 实现联用的关键实现联用的关键 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法GC-MSGC-MS对接口的一般要求是对接口的一般要求是：能使色谱分离后的各组分尽可能多地进入能使色谱分离后的各组分尽可能多地进入质谱仪，并使载气尽可能少地进入质谱系统。质谱仪，并使载气尽可能少地进入质谱系统。维

5、持离子源的高真空。维持离子源的高真空。组分在通过接口时应不发生化学变化。组分在通过接口时应不发生化学变化。接口对试样的有效传递应具有良好的重现接口对试样的有效传递应具有良好的重现性。性。接口的控制操作应简单、方便、可靠。接口的控制操作应简单、方便、可靠。接口应尽可能的短接口应尽可能的短, ,以使试样尽可能快速通以使试样尽可能快速通过接口。过接口。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法GC-MSGC-MS的接口有的接口有直接导入型直接导入型和和浓缩型浓缩型 直接导入型直接导入型 装置结构简单，容易维护，装置结构简单，容易维护，但它无浓缩作用但它无浓缩作用具备去除载气、浓缩样具备去除载

6、气、浓缩样品的功能，即具有分子品的功能，即具有分子分离的能力分离的能力 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法GC-MSGC-MS中的质谱应满足下列要求：中的质谱应满足下列要求：u真空系统不受载气流量的影响真空系统不受载气流量的影响u灵敏度和分辨率与色谱系统匹配灵敏度和分辨率与色谱系统匹配u扫描速度与色谱流出速度相适应扫描速度与色谱流出速度相适应第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（1 1）离子源）离子源 电子轰击源（电子轰击源（EIEI）是）是GC-MSGC-MS中最常用的离子源中最常用的离子源 优点优点：谱图重现性

7、好谱图重现性好 有较多的碎片离子，提供丰富的结构信息有较多的碎片离子，提供丰富的结构信息灵敏度高灵敏度高 化学电离源（化学电离源（CICI）也是也是GC-MSGC-MS配置的离子源之一配置的离子源之一 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（2 2）质量分析器）质量分析器四极质量分析器四极质量分析器扫描速度快，并可从正离子到负离子检测自扫描速度快，并可从正离子到负离子检测自动切换，而且灵巧轻便，价格便宜，是动切换，而且灵巧轻便，价格便宜，是GC-MSGC-MS中最流行的质量分析器。中最流行的质量分析器。离子阱质量分析器离子阱质量分析器飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器第二十一章第

8、二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法3 3色谱单元色谱单元 用于用于GC-MSGC-MS色谱系统应该符合质谱仪的一些色谱系统应该符合质谱仪的一些特殊要求。特殊要求。主要是：主要是： 固定相应选择耐高温，不易流失的固定液，固定相应选择耐高温，不易流失的固定液，最好用键合相。最好用键合相。 载气应不干扰质谱检测，一般常用氦气。载气应不干扰质谱检测，一般常用氦气。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（三）气相色谱质谱分析的应用（三）气相色谱质谱分析的应用GC-MSGC-MS联用分析的联用分析的灵敏度高灵敏度高，适合于，适合于低分子化低分子化合物合物( (相对分子质量相对分子质量100

9、01000）的分析，尤其适）的分析，尤其适合于合于挥发性成分挥发性成分的分析。的分析。在药物的生产、质量控制和研究中在药物的生产、质量控制和研究中在中药挥发性成分的鉴定在中药挥发性成分的鉴定食品和中药中农药残留量的测定食品和中药中农药残留量的测定体育竞赛中兴奋剂等违禁药品的检测体育竞赛中兴奋剂等违禁药品的检测环境监测环境监测第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法二、高效液相色谱质谱联用二、高效液相色谱质谱联用 （一）原理（一）原理 以高效液相色谱为分离手段，以质谱为以高效液相色谱为分离手段，以质谱为鉴定和测定手段，通过适当接口鉴定和测定手段，通过适当接口(interface)(in

10、terface)将二者联接成完整仪器将二者联接成完整仪器。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（二）高效液相色谱质谱联用仪器（二）高效液相色谱质谱联用仪器1 1高效液相色谱质谱接口和离子高效液相色谱质谱接口和离子化 接口装置接口装置必须既能满足液、质两谱在线必须既能满足液、质两谱在线联用的真空匹配要求，又能实现被分析联用的真空匹配要求，又能实现被分析组分的离子化。组分的离子化。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法离子化方式离子化方式有两种：有两种：u试样在离子源中以气体形式被离子化试样在离子源中以气体形式被离子化是从固体表面或溶液中溅射出带电离子是从固体表面或溶液中

11、溅射出带电离子 大气压离子化大气压离子化-最常用最常用电喷雾离子化（电喷雾离子化（ESIESI）大气压化学离子化大气压化学离子化 (APCI)(APCI)大气压光离子化大气压光离子化 (APPI)(APPI) 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法电喷雾离子化是将溶液中试样离子转化为气电喷雾离子化是将溶液中试样离子转化为气态离子的一种接口态离子的一种接口 带电液滴带电液滴的形成的形成溶剂蒸发和溶剂蒸发和液滴碎裂液滴碎裂 离子蒸发形离子蒸发形成气态离子成气态离子第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法电喷雾接口示意图电喷雾接口示意图 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱

12、联用分析法电喷雾离子化过程示意图电喷雾离子化过程示意图 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法uHPLC-ESI-MSHPLC-ESI-MS谱图主要给出谱图主要给出准分子离子准分子离子的相关的相关信息，例如在单电荷情况下的信息，例如在单电荷情况下的M+HM+H+ +、M+NaM+Na+ +、MMHH 等，对于生物大分子如蛋白质、肽等，等，对于生物大分子如蛋白质、肽等，还能产生大量的多电荷离子。还能产生大量的多电荷离子。uESIESI常用于常用于强极性、热不稳定化合物及高分子强极性、热不稳定化合物及高分子化合物化合物的测定。的测定。uESIESI的主要缺点是只能允许非常小的流动相流的

13、主要缺点是只能允许非常小的流动相流量。量。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法大气压化学离子化接口将溶液中组分的分子大气压化学离子化接口将溶液中组分的分子转化为气态离子的一种接口转化为气态离子的一种接口 uAPCIAPCI适用分析有适用分析有一定挥发性一定挥发性的的中等极性与弱极中等极性与弱极性性，相对分子质量在，相对分子质量在20002000以下的以下的小分子化合物小分子化合物。u最大优点是使最大优点是使HPLCHPLC与与MSMS有很高的匹配度有很高的匹配度, ,允许允许使用使用流速高流速高及及含水量高含水量高的流动相，极易与的流动相，极易与RP-RP-HPLCHPLC条件匹

14、配。条件匹配。u与与ESIESI相比，相比，APCIAPCI对流动相种类、流速及添加对流动相种类、流速及添加物的物的依赖性较小依赖性较小。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（2 2）质量分析器）质量分析器四极质量分析器四极质量分析器离子阱质量分析器离子阱质量分析器飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法串联四极质量分析器串联四极质量分析器-使用较广泛使用较广泛 将三个四极质量分析器串联起来使用将三个四极质量分析器串联起来使用 u第一个四极质量分析器进行质量分离第一个四极质量分析器进行质量分离u第二个四极质量分析器第二个四极质量分析器

15、-碰撞池，产生产物离子碰撞池，产生产物离子u产物离子由第三个四极质量分析器分离分析产物离子由第三个四极质量分析器分离分析 串联四极质量分析器能够进行选择反应监串联四极质量分析器能够进行选择反应监测，选择性更高，使用串联四极质量分析器的测，选择性更高，使用串联四极质量分析器的质谱称为质谱称为串联质谱串联质谱。 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法3 3色谱单元色谱单元uHPLC-MSHPLC-MS中的色谱柱一般短柱，以缩短分析中的色谱柱一般短柱，以缩短分析时间，最常用的固定相为时间，最常用的固定相为ODSODS。uHPLC-MSHPLC-MS对流动相的基本要求是对流动相的基本要求是

16、不含非挥发不含非挥发性盐类性盐类，以防其析出堵塞毛细管等。，以防其析出堵塞毛细管等。u所用溶剂的纯度最好都是所用溶剂的纯度最好都是色谱纯色谱纯。u流动相中挥发性电解质如甲酸、乙酸、氨水、流动相中挥发性电解质如甲酸、乙酸、氨水、乙酸铵等的浓度也不能太高。乙酸铵等的浓度也不能太高。u流动相的流动相的pHpH、流速均对检测灵敏度有很大影、流速均对检测灵敏度有很大影响。响。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法1 1高效液相色谱高效液相色谱- -质谱联用的特点质谱联用的特点 适用的范围宽。适用的范围宽。 提供各种信息。可产生准分子离子和多级提供各种信息。可产生准分子离子和多级质谱可提供丰富

17、的结构信息。质谱可提供丰富的结构信息。 有很高的灵敏度和样品通量。有很高的灵敏度和样品通量。 可在色谱分离不完全的情况下对复杂基质中可在色谱分离不完全的情况下对复杂基质中的痕量组分进行快速定性和定量分析的痕量组分进行快速定性和定量分析。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法uHPLC-MSHPLC-MS分析实验条件的选择分析实验条件的选择： （1 1）流动相和流量流动相和流量：常用流动相为水、甲醇、乙腈：常用流动相为水、甲醇、乙腈及它们的混合物，可用醋酸、甲酸或它们的铵盐溶及它们的混合物，可用醋酸、甲酸或它们的铵盐溶液调节液调节pH

18、pH ，应避免磷酸盐或离子对试剂等。流量对，应避免磷酸盐或离子对试剂等。流量对LC-MSLC-MS分析有较大影响。分析有较大影响。 （2 2）离子检测模式离子检测模式：碱性物质选择正离子检测模式，：碱性物质选择正离子检测模式，可用醋酸或甲酸使试样酸化至可用醋酸或甲酸使试样酸化至p pK Ka a2 2。酸性物质及。酸性物质及含有较多强电负性基团的物质，选择负离子检测模含有较多强电负性基团的物质，选择负离子检测模式。式。 （3 3）温度温度：接口的干燥气体温度应高于待分析物沸：接口的干燥气体温度应高于待分析物沸点点2020左右，同时要考虑物质的热稳定性和流动相左右，同时要考虑物质的热稳定性和流动

19、相中有机溶剂的比例。中有机溶剂的比例。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法三、毛细管电泳质谱联用三、毛细管电泳质谱联用CECE的高效分离能力与的高效分离能力与MSMS鉴定结构鉴定结构能力的有机结合能力的有机结合 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法若实现若实现毛细管电泳毛细管电泳-ESI-ESI-质谱联用质谱联用，须解决的，须解决的问题：问题：电压匹配问题。电压匹配问题。 CECE是依赖电渗作为流体的动力，若与质谱联接时，是依赖电渗作为流体的动力，若与质谱联接时，质谱的高真空与质谱的高真空与CECE造成的真空差，将会引起造成的真空差，将会引起CECE的电渗的电渗流的

20、扰动，破坏分离。流的扰动，破坏分离。 CECE的进样量小，的进样量小，要求要求MSMS要有很高的灵敏度。要有很高的灵敏度。CECE分离工作大都是使用磷酸盐缓冲溶液来完成，与分离工作大都是使用磷酸盐缓冲溶液来完成，与MSMS联用时，联用时，只能用易挥发盐的缓冲盐溶液。只能用易挥发盐的缓冲盐溶液。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法四、色谱质谱的扫描模式及四、色谱质谱的扫描模式及 其提供的信息其提供的信息色谱色谱- -质谱联用分析扫描模式质谱联用分析扫描模式u全扫描（全扫描（full scanningfull scanning）u选择离子监测选择离子监测(SIM)(SIM)u选择反应

21、监测选择反应监测(SRM)(SRM)第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（一）全扫描（一）全扫描 全扫描是质量分析器在给定的时间范全扫描是质量分析器在给定的时间范围内对给定质荷比范围进行无间断地扫描，围内对给定质荷比范围进行无间断地扫描，获得样品中每一个组分（或在某一特定时获得样品中每一个组分（或在某一特定时刻）的全部质谱。在这种扫描模式下，可刻）的全部质谱。在这种扫描模式下，可以获得各种定性和定量信息。以获得各种定性和定量信息。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法1 1色谱质谱三维谱色谱质谱三维谱 X X坐标表示质荷比坐标表示质荷比m m/ /z z，Y Y坐标表

22、示时间或坐标表示时间或连续扫描的次数，连续扫描的次数，Z Z坐标表示离子流的强坐标表示离子流的强度度( (离子丰度离子丰度) )。 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法2.2.质谱质谱 将全扫描得到的分子离子将全扫描得到的分子离子 或准分子或准分子 离离子（子（M+H+M+H+、MMHH 、M+Na+M+Na+等）及所有碎片离等）及所有碎片离子的质荷比与其对应的离子流的相对强度作图子的质荷比与其对应的离子流的相对强度作图M+给出总离子流色谱图上每一个色谱峰的质谱给出总离子流色谱图上每一个色谱峰的质谱第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法 3.3.总离子流色谱图（总离子

23、流色谱图（TICTIC）是总离子流强度是总离子流强度随时间（扫描次数）变化的色谱图随时间（扫描次数）变化的色谱图 其中对应某一时间点的峰高是该时间点流其中对应某一时间点的峰高是该时间点流进的组分的所有质荷比的离子强度的加和进的组分的所有质荷比的离子强度的加和。 给出保留给出保留值、峰高值、峰高和峰面积和峰面积第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（二）选择离子监测（二）选择离子监测u选择离子监测是对一个或一组特定离子进行选择离子监测是对一个或一组特定离子进行检测的技术。检测的技术。u

24、只检测一个质量的离子称为只检测一个质量的离子称为单离子监测单离子监测(SIM)(SIM)u检测多离子的称为检测多离子的称为多离子检测多离子检测(MID)(MID)u选择离子监测可以把全扫描模式所得的复杂选择离子监测可以把全扫描模式所得的复杂的总离子色谱图变得非常简单，即获得的质的总离子色谱图变得非常简单，即获得的质量色谱图。提高了灵敏度，同时有更快的扫量色谱图。提高了灵敏度，同时有更快的扫描速度。选择离子监测主要用于描速度。选择离子监测主要用于定量分析定量分析。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法选择反应监测能对复杂混合物中的痕量组分进行选择反应监测能对复杂混合物中的痕量组分进行

25、快速鉴别和定量分析，选择性高，灵敏度高。快速鉴别和定量分析，选择性高，灵敏度高。此外，产物离子扫描、前体离子扫描和中性丢此外，产物离子扫描、前体离子扫描和中性丢失扫描三种模式也是串联质谱的检测模式。失扫描三种模式也是串联质谱的检测模式。第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法第二节第二节 其他联用分析法其他联用分析法一、气相色谱傅立叶变换红外光谱联用一、气相色谱傅立叶变换红外光谱联用（一）气相色谱傅立叶变换红外光（一）气相色谱傅立叶变换红外光 谱联用仪器谱联用仪器 由气相色谱仪、接口、傅立叶变换由气相色谱仪、接口、傅立叶变换红外光谱仪及计算机系统四部分组成。红外光谱仪及计算机系统四部

26、分组成。 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（二）气相色谱傅立叶变换红外光（二）气相色谱傅立叶变换红外光谱联用获得的谱图谱联用获得的谱图1.1.实时三维谱图实时三维谱图 2.2.重建色谱图重建色谱图 在相应软件控制下，仪器进行实时傅立叶变换，在在相应软件控制下，仪器进行实时傅立叶变换，在显示器上实时显示显示器上实时显示GCGC馏分的气态馏分的气态IRIR谱图，其谱图，其x x轴为波轴为波数，数，y y轴为吸光度，轴为吸光度，z z轴为时间轴为时间由红外检测器记录的干涉图经计算机处理后得由红外检测器记录的干涉图经计算机处理后得到的色谱图到的色谱图 3 3红外光谱图红外光谱图第二十

27、一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法（1 1）化学图）化学图 （2 2）Gram-SchmidtGram-Schmidt重建色谱图重建色谱图 （3 3）红外总吸收）红外总吸收度重建色谱图度重建色谱图 重建色谱图包括：重建色谱图包括： 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法核磁共振波谱是测定有机化合物结构的最强有力核磁共振波谱是测定有机化合物结构的最强有力的技术之一的技术之一 但是实现这种联用又是最具有挑战性的一门技术但是实现这种联用又是最具有挑战性的一门技术 HPLCHPLC流动相中的质子严重干扰组分的流动相中的质子严重干扰组分的1H-NMR1H-NMR谱谱梯度洗脱时，溶剂的浓度不断变化，梯度洗脱时，溶剂的浓度不断变化，值也不值也不 断变化断变化核磁共振波谱的灵敏度较低核磁共振波谱的灵敏度较低NMRNMR难于与难于与HPLCHPLC在线联用在线联用 第二十一章第二十一章 色谱联用分析法色谱联用分析法 HPLC-NMR HPLC-NMR能够获得复杂试样中微量组能够获得复杂试样中微量组分的定性信息及二级结构信息，能测定这分的定性信息及二级结构信息，能测定这些组分的氢谱、碳谱及各种相关谱，必将些组分的氢谱、碳谱及各种相关谱，必将成