酵母单杂交试验方法

1、酵母单杂分析酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通 过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别 DNA结合位点并发现潜在的结 合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质 分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势； 而且酵母属真核细胞，通过 酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达 调控的情况。【实验目的】了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事 项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。【实验原理】酵母

2、单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与 DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示， 将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行 cDNA融合表达文库时，编码目的转 录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子） 与顺式作用元件结合，就可以激活 Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报 告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。“ Matchmaker

3、 Gold Yeast OnHybrid Library Screening System 提供了一个简 单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选 发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。The Matchmaker Gold On e-Hybrid Library Scree ning process主 要包括以下步骤：1将已知序列(bait)克隆到pAbAi载体。2 pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与

4、酵母基因组发生重组，生成 bait/reporter 酵母菌株。3检测Y1HGold bait菌株AbAir基因的本底表达水平。4合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重 组筛选cDNA文库。5筛选结果的验证和分析。【实验准备】1仪器设备微量取液器(2.5 H_; 20 H_; 50 H_; 100 H_; 200 田_; 1000 »L)、PCR 仪、 低温离心机、台式离心机、CHROMA SPINtm+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳 系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金 属浴、酒精浴、无菌接种环、10 c

5、m培养皿、15 cm培养皿等。2实验材料YIHGold酵母株、TOP10大肠杆菌菌株、各种方法提取的 RNA、pGADT7-Rec 质粒和pBait-AbAi质粒等。3主要试剂(1) Advantage 2 PCR试剂盒、Easy Yeast Plasmid Isolation剂盒、MatchmakerInsert Check PCR Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2(2) 各种基础培养基和营养缺陷培 ，养基：minimal SD base minimal SD agar base YPD medium，YPD agar medium，-Leu D

6、O supplement, -Ura DO supplemen，腺苷酸(adenin®，PEG8000, carring DNA，aureobasidin A, LB培养基, 氨苄西林。(3) NaCl 溶液(0.9%)、sodium acetate (3 mol/L )、50% PEG、10 x LiAc (1 mol/L)、10xTE buffer、DTT (100 mmol/L)、RNaseH、限制性内切酶。【实验方法】1 pBait-AbAi载体的构建(酵母报道子的构建)注：酵母报道子(pBait-AbAi )包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， 且插入到pAbAi载体Ab

7、Air报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含 目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于 长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。(1) 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端(建议合成一个目的序列的突变序列 作为对照，以排除可能的假阳性)。(2) 用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100mol/L。(3) 将正向链和反向链按照1:1的比例混合(退火后的双链寡核苷酸最大浓度为 50 Jmol/L)。(4) 95 C保温30 s,去除二级结构。(5) 72 C 保温

8、 2 min，37 C 保温 2 min，25 C 保温 2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。(6) 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C冰箱备用。(7) 酶切1 JL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 5OI/L（9）在连接反应管中加入如下成分:pAbAi 载体（50 ng/L）1.0儿annealed oligonucleotide ( 0.5 Jmol/L)1.0儿10 x T4 DNA ligase buffer1.5儿BSA (10 mg/mL)

9、0.5 UNuclease-free H2O10.5 4T4 DNA ligase (400 UM)0.5此总体积15 U注：如果有必要，可用1 JL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成 Bait-Reporter酵母菌株（图）Linearize pBait-AbAi and integrate into the ur&3-52 lous of Y1H Gold图3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图4(1) 用

10、BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 儿 pBait-AbAi ,pMutant-AbAi ,p53-AbAi 质粒， 使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。(2) 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤用 1 .酶切后的质粒 转化Y1HGold酵母。(3) 稀释每个转化体系至 1/10、1/100、1/1000,分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。(4) 在 PCR 管中

11、加 25 屮 PCR-grade H2O。(5) 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头 伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。(6) 向每个管中加入 25 Jl Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。每 个PCR管中现已含有如下反应物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25 JlH2O/yeast25 7总体积50 Jl(7) 按下述程序进行PCR反应;(8)95 C1

12、min98 C10 s >55 C30 s68 C2 min取5卩1 PCR产物，用30 cycles1%的琼脂糖凝胶电泳分析。16注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约 1.4 kb。_AbArURA3图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是:阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35 kb+in sert size（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura 平板上划线培养。30 C孵育3 d后，将平板置于4 C保存，即为新构建 的 Y1HGoldBait/AbA

13、i菌株和p53/AbAi对照菌株。（10） 经过长期放置后，挑取单克隆在 YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用1 mL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75% 甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 C保存。3检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到 pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱 饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidin A 抑制浓度为 100 ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株

14、AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株 报告基因本底表达所需的AbA浓度。（1） 分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCI重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100 7）。（2） 在下述培养基上分别涂布100 Jl重悬后的菌液，30 C培养2-3 doSD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）预期结果如下所示：表1 AbAr基因预期本底表达结果AbA/ （ n g/mL）Y1HGoldp

15、53-AbAi克隆数Y1HGoldpBait-AbAi克隆数0约 2000约 20001000Bait depe ndent1500Bait depe ndent2000Bait depe ndent（3）在进行文库筛选时，使用 AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100 ng/mL）,以彻底抑制诱饵菌株的 生长。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果 1000 ng/mL的AbA浓 度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结

16、合的 内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库cDNA的合成提取试材总 RNA，进行反转录合成 cDNA。合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。（1） cDNA第一链的合成准备高质量的poly A和/或总RNA，用human placenta poly A+RNA作为阳性 对照。注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。在微量离心管中加入如下反应物：RNA 模板（0.025-1.0 Jg poly A 和/或 0.10-2.0 Jg 总 RNA）1-2 JlCDS III（oligo-dT）or CDS 111/

17、6（ random）引物1.0 JlDeionized H2O （使总体积达到 4.0 T）1-2 Jl总体积4.0川在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1川（1 -g） control polyA+RNA 。72 C孵育2 min。冰上放置2 min，轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5X first-strand buffer2.0山DTT (100 mmol/L)1.0山dNTP mixture (10 mmol/L)1.0SMART M-MLV RT1.0屮总体积5.0 Jl注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是 cDNA合成

18、的 起始关键步骤，变性后的 RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过 2 min。 如果用的是CDS III/6随机引物，25-30 C保温10 min。如果用的是CDS III 引物，省略此步，进行步骤。 42 C保温10 min。 加入1 T SMART III oligo，充分混合，42 C保温1 h。 75 C保温10 min终止第一链的合成。 降至室温，加入1 T RNase H（ 2 U）。11 37 C 保温 20 min。12 cDNA第一链合成产物应于-20 C保存，可用3个月。(2) long distanee PCR (LD-PCR)合成 cDNA 第二链根据合成cDNA

19、第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳 的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表2 RNA量与最佳热循环数总RNA/也Poly A+RNA/ Jg循环数1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反应混合物中加入如下物质(每个样品做 2个100川体系，对照做1个100屮体系):First-stra nd cDNA ( from protocol A)2 JlDei on ized H2O70 “10 x adva nt

20、age 2 PCR buffer10 '-l50 x dNTP mix2 Jl5' RAC引物2 Jl3' RAC引物2 JlMelt ing solution10 Jl50 x adva ntage 2 polymerase mix2 41总体积100 Jl按照以下程序进行PCR反应：1个循环95 乜 30 sX个循环95 七 10 s 686 min1个循环685 min取7屮PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用 1 kb DNA ladder。(2) 使用 CHROMA SPIN+TE-400 柱纯化 ds cDNA为每一个要纯化的 cDNA样品准备一

21、个 CHROMA SPIN+TE-400柱。将纯化柱翻转几次，充分悬浮 gel matrix。移去柱的顶盖和底盖，将柱放入 2 ml收集管中。将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的 内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。700 g离心5 min,纯化的cDNA收集到管中。将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。加入1/10体积3 mol/L醋酸钠(pH5.3)，混匀。加入2.5倍体积无水乙醇。-20 C冰冻1 h0(11) 室温，14000

22、r/min 离心 20 min。(12) 小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。(13)14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液(14) 沉淀于空气中干燥10 min。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。(15) 用20川灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯 化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。5构建并筛选酵母单杂交文库(cDNA融合表达文库的构建及筛选)(1) 构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测 Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。(2) 按SMART tech no lo

23、gy步骤合成ds cDNA，其浓度为2-5弋/20儿。(3) 用Yeast Transformation System 2的方法转化酵母，在转化体系中加入如下 物质： cDNA 文库转化 Y1HGoldBait/AbAi菌株20 屮 SMART-amplified ds cDNA (2-5 乜)6 Jl pGADT7-Rec， (Sma I-linearized) (3 Jg) Y1HGold 53/AbAi的转化5 屮 p53 fragme nt (125 Jg)2 屮 pGADT7-Rec， (SmaI-linearized) (1 Jg)将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/10

24、00 1/10000后，各取100 Jl涂100 mm平板。文库转化涂 SD/-Leu和SD/-Leu/AbA 平板，对照 p53转化涂SD/-Leu和 SD/-Leu/AbA200 平板。(4) 将剩余的所有文库转化混合物(约 15 ml)涂在150 mm SD/-Leu/AbA平 板上，每板涂150屮。(5) 倒置培养3-5 do(6) 3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆注：所筛选的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可 能性。筛选的 克隆数=cfu/ml on SD/-Leu x dilution factor x resu

25、spension volume (15ml)例如：resuspension volume=15 mlPlating volume=100 Jl250 colo nies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clo nes scree ned=250 cfu/0.1 mx 100 x 15 ml=3.75 millio n(7)预期结果阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/A

26、bA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目 取决于诱饵序列。6阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离(1) 阳性克隆重新划线培养，进行表型确认 将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。 2-4 d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。(2) 酵母克隆PCR消除重复克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (，对插入到 pGADT7 载体中的 cDNA片段进行扩增。PCR管中加入以下反应物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25 JlH2O/Yeast25 T总体积50 Jl按下述程序进行PCR反应:9

27、4 C 1 min98 °C 10 s68 °C 3 min PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常， 这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用Alu I或Hae III或者其它常用的限制性内切酶消化 PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分 析。 如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。 为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。（3）阳性cDNA质粒的分离获取 酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着 阳

28、性克隆里不只含有能激活 AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表 达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过 转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取 阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。 从酵母中获取阳性cDNA质粒为了鉴定阳性互作相关的基因，用 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （ 转化E coli并分离阳性cDNA质粒用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进行克隆，用LB加100 g/ml ampicillin进行选择(4) 鉴别阳性和假阳性互作酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性 阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活 AbAr报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认： 用 Yea