非创伤性预处理对大鼠缺血心肌保护效应机制的探讨

1、    非创伤性预处理对大鼠缺血心肌 保护效应机制的探讨        摘要目的：探讨非创伤性下肢缺血预处理对大鼠心肌保护效应的机制。方法：用雄性SD大鼠36只，分对照、缺血再灌注、经典缺血预处理及非创伤性下肢缺血预处理4组。分别观察以下指标：血浆一氧化氮(NO)水平；心肌热休克蛋白70(HSP70)mRNA表达；心肌5'-核苷酸酶(5'-NT)及过氧化氢酶(CAT)活性。结果：经典及非创伤性下肢缺血预处理后，血浆NO水平显著高于缺血再灌注组和对照组

2、(P0.01)，心肌HSP 70 mRNA表达明显增强，心肌5'-NT、CAT活性升高(P0.05， vs I/R)，而经典及非创伤性下肢缺血预处理两组间上述指标无显著差异(P0.05)。结论：非创伤性下肢缺血预处理保护心肌的机制可能与经典缺血预处理相似，均是通过提高心肌内源性保护物质NO、HSP70 mRNA、CAT及5'-NT显示预处理效应。主题词大鼠； 局部缺血； 再灌注中分类号Q463文献标识码A文章编号1000-4718(2000)09-0835-04 Study on protective mechanism of non-wounded ischemicpreco

3、nditioning on rat ischemia/reperfusion myocardiumLU Yan-zhen(Department of Pathophysiology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000， China)DONG Chuan-ren,LIUYong-ming,ZHANG You-yun,MA Chun-yan(Department of Pathophysiology,Hubei Medical University, Wuhan 430071, China) Abstract AIM:To investigate

4、probable protective mechanism of non-wounded legs ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion(I/R) myocardium. METHODS: 36 male SD rats, weighting (250±30) g,were divided into 4 groups.They are normal control(NC);I/R; classical ischemic preconditioning(C-IPC)and non-wounded legs ischemic p

5、reconditioning(N-WIPC). NO in plasm,expression of myocardial HSP 70 mRNA, the activities of 5'-NT and CAT of myocardium were observed in all groups. RESULTS:The level of NO in plasm significantly enhanced in groups C-IPC and N-WIPC compared with that in groups I/R and NC(P0.01),expression of myo

6、cardial HSP 70 mRNA was greatly increased in both C-IPC and N-WIPC groups, the activities of 5'-NT, CAT of myocardium were also raised in groups C-IPC and N-WIPC (P0.05 vs I/R),but there was no difference between C-IPC and N-WIPC(P0.05). CONCLUSION:The possible protective mechanism involved in N

7、-WIPC is similar to that in C-IPC, which is due to increase of endogenous myocardial protective substances.MeSHRats; Ischemia; Reperfusion 本室已证实，无论是非创伤性下肢缺血预处理或是经典心脏缺血预处理，均可获得明显缩小心肌梗塞范围，改善心脏功能，减轻心肌脂质过氧化反应及心肌酶漏出等预处理效应。本实验通过监测大鼠血浆一氧化氮(nitric oxide)含量，心肌5'-核苷酸酶(5'-nucleotidase)及过氧化氢酶(catalase)活

8、性和热休克蛋白70(HSP70)mRNA表达的变化，旨在为探讨这两种预处理方式的机制提供实验资料。材料和方法一、 动物模型复制与分组雄性SD大鼠，体重(250±30)g，用20乌拉坦(1 g*kg-1 ip)麻醉。气管插管人工机械通气。胸骨左缘第四肋间开胸，剪开心包，30丝线环左冠脉前降支距左心耳下缘2 mm处穿过。稳定后，取心电正常者随机分4组：(1)正常对照(NC)组,n=9,留线不结扎冠脉旷置50及120 min;(2)缺血再灌(I/R)组,n=9,结扎左冠脉前降支阻断血流30min, 再灌注20及90min;(3)经典缺血预处理(C-IPC)组,n=9,按经典Murry法复制

9、，即结扎冠脉前降支5min,再灌注5min,反复4次。以后处理同I/R组;(4)非创伤性下肢缺血预处理(N-WIPC)组,n=9,麻醉后，以止血带捆绑双下肢至股动脉搏动不能触及，阻断血流5min后松开5min，反复4次。以后处理同I/R组。二、主要试剂NO试剂盒为南京聚力生物医学工程所产品；质粒DNA由上海第二军医大学宋亮年教授惠赠；Random标记盒购自Promega公司；DAB及5'-NT分别为sigma和中科院上海生物化学研究所产品。三、观测指标(一) 血浆NO含量测定各组于再灌注20 min(NC组持续观察50 min)，左颈总动脉取抗凝血液2 mL，以2 000×g

10、 离心10 min，分离血浆，以NO测试盒测定，按说明操作。(二) 心肌组织HSP 70 mRNA表达各组于再灌注90 min(NC组持续120 min)，速取左心室组织约100mg按酸性盐酸胍-酚-氯仿一步法1 提取心肌总RNA。取30gRNA经1琼脂糖凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上。80烘干。质粒DNA经BamHI、EcoRI双酶切后，低溶点琼脂糖凝胶回收2.3kb片段。用Random标记盒进行放射性标记。按分子克隆第2版方法进行Northern blot分析。(三) 心肌5'-NT、CAT活性测定 实验结束后速取左心室结扎线下小块组织，2多聚甲醛固定10 min左右，切片。按酶

11、组织细胞化学技术2结果一、 心肌5'-NT活性变化 结果如表1示，I/R组酶活性最低(P0.05 vs NC组)，C-IPC、N-WIPC组酶活性明显高于I/R组(P0.05)。GroupGrades of reactionTotal<"00 (311 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309184547561" 64 32>ABCDNC84 11 5 01000.5000±0.0577 I/R 24 3338 5 100 0.8200±0.0577 C-IPC 5533 92

12、100 0.6300±0.0577* N-WIPC7123 6 0 100 0.5600±0.0577*     P0.05 vs NC group；*P0.05 vs I/R group. 二、心肌CAT活性变化结果见表2，C-IPC、N-WIPC组酶活性明显高于I/R组,I/R组酶活性低于NC组(P0.05)。 GroupGrades of reactionTotal<"00 (311 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309184547561" 6

13、4 32>ABCDNC 101163 0120 0.5000±0.0577 I/R353028 7100 0.7700±0.0577C-IPC 7512 9 4 100 0.5500±0.0577* N-WIPC 77 13 73 100 0.5400±0.0577*      P0.05 vs NC；?P0.05 vs I/R. 三、血浆NO变化 如表3示，I/R组血浆NO含量显著低于NC组(P0.01)，提示I/R组血管内皮严重受损；而C-IPC、N-WIPC组含量显著高于I/R组(P0.01)，甚至高于

14、NC组(P0.01)，说明这两种方法处理都使NO释放增加，两组比较无显著差异(P0.05)。 表3血浆NO2-/NO3-含量的变化Tab 3 Changes of the content of NO2-/NO3-GroupNO-2/NO-3(mol/L) NC 23.38±3.33 I/R 11.59±3.16 C-IPC 42.80±15.00* N-WIPC 43.40±10.25*     P0.05,P0.01 vs NC； *P0.01 vs I/R. 四、心肌HSP 70 mRNA表达的变化Northo

15、rn杂交结果见1，C-IPC组、N-WIPC组HSP 70 mRNA表达明显高于I/R组；I/R组轻度表达，而NC组无HSP 70 mRNA表达。    Fig 1Northern blot analysis of HSP 70 mRNA.NC group, no expression; I/R group, low-grade expression;C-IPC and N-WIPC groups; distinct expression.1心肌HSP 70 mRNA表达的Northern blot分析讨论自发现IPC对心肌有保护作用以来，关于其机制已成

16、为研究热点。目前已提出不少假说如应激蛋白合成，NO、腺苷释放，K+-ATP通道开放和PKC、5'-NT激活等，本实验着重观测了NO、HSP 70 mRNA表达及心肌酶学改变与IPC的关系。结果发现C-IPC组与N-WIPC组动物心肌5'-NT、CAT活性明显增加(P0.05， vs I/R组),HSP70mRNA显著表达，同时血浆NO水平也显著增高(P0.01， vs I/R、NC组)。文献报道,内源性NO释放,5'-NT、CAT活性增高是IPC机制的重要方面，HSP70是IPC重要的心肌内源性保护物质。在犬的IPC实验中发现3，IPC效应是通过L-精氨酸:一氧化氮通路

17、所致。用NO合成抑制剂L-NAME可以取消IPC效应。若分别用L-arg和SIN-1预处理可以明显改善心肌的I/R损伤4。许多实验证实HSP 70 mRNA表达在IPC时明显增加，用actinomycin-D及cycloheximide分别阻断了HSP70基因转录及翻译，阻止HSP70合成，完全阻断了对大鼠心肌的保护作用5。直接将HSP70基因转录入大鼠心肌细胞能显著地增加其抗I/R损伤的能力6。Kitakaze等7报道PC能使犬5'-NT活性增加，当加入5'-NT抑制物AOPCP后，该保护效应消失。用polymyxin B和prazosin阻断细胞外5'-NT的激活，

18、则IPC的保护作用也消失，说明5'-NT是IPC的机制之一。Currie等89。同时，双下肢缺血再灌注过程中可以产生少量的氧自由基。少量氧自由基在预处理效应中起着一定的作用10。通过儿茶酚胺类和/或氧自由基介导，调动心肌内源性保护物质的释放而显示IPC效应。卢彦珍（长治医学院病理生理学教研室， 山西 长治 046000）董传仁（湖北医科大学病理生理学教研室， 湖北 武汉 430071）刘永明（湖北医科大学病理生理学教研室， 湖北 武汉 430071）张友云（湖北医科大学病理生理学教研室， 湖北 武汉 430071）马春艳（湖北医科大学病理生理学教研室， 湖北 武汉 430071）参考文

19、献1Chomzynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinuium thiocynate-phend-chloroform extractionJ. Anal Biochem,1987,162:156-159.2小川和郎，中根一穗，主编. 酶组织细胞化学技术M. 钟慈声主译.上海：上海医科大学出版社，1989. 132-135. 3Vegh A,Szekers L, Parratt J. Preconditioning of the ischemic myocardium,involvement of

20、 the L-arginine nitric oxide pathwayJ.Br J Pharmacol,1992,107:648-652.4Richard V, Blanc T, Kaeffer N,et al. Myocardial and coronary endothelial protective effects of acetylcholine after myocardial ischemia and reperfusion in rats: role of nitric oxideJ. Br J Pharmacol,1995,115:1532-1538.5肖献忠，王燕如，黄生宁，等.从热休克基因表达探讨心肌细胞对损伤的内源性保护作用及机制J.中国病理生理杂志,1995,11:741-742.6Mestril R,Chi S,Sayen R,et al.Expression of inducible stress protein 70 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia-induced injuryJ. J Clin Invest,1994,93