A型肉毒毒素抑制大鼠变应性鼻炎鼻溢及VIP在鼻腔粘膜的免疫表

1、A型肉毒毒素抑制大鼠变应性鼻炎鼻溢及VIP在鼻腔粘膜的免疫表达(1)】 目的: 确定A型肉毒毒素(BTXA)对大鼠变应性鼻炎鼻溢是否具有治疗的作用，以及毒素使用前后血管活性肠肽（VIP）免疫表达和组织学改变. 方法: 卵清蛋白（Ovalbumin）致敏Wistar大鼠制作变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)动物模型，16只大鼠随机分为3组，即对照组（n=6）；致敏组（n=10）；致敏后A型肉毒毒素（BTXA）用药组（n=5）. 观察给予BTXA前后大鼠鼻部症状和体征的变化. 采用组织学和免疫组织化学方法观察鼻腔粘膜形态学改变以及对VIP物质表达的影响. 结果: 致敏组动物鼻

2、分泌量明显增多. 组织学结果显示：致敏组鼻腔粘膜水肿、腺体增生、嗜酸性粒细胞增多. 免疫组织化学结果显示：致敏组腺体周围VIP纤维密集，呈束状. 致敏后BTXA用药组，鼻分泌量明显减少，致敏后BTXA用药组与致敏组相比鼻分泌量差异有显著性（P0.05），但鼻痒及喷嚏症状无明显改变. 组织学结果示：鼻粘膜上皮完整，腺体明显减少，腺管萎缩. 免疫组织化学结果示：致敏组动物致敏后 BTXA 用药组腺体周围VIP纤维减少，未见束状VIP纤维. 结论: BTXA能缓解变应性鼻炎流涕，VIP纤维密度和数量免疫阳性反应减少，能治疗变应性鼻炎的鼻溢症状.【关键词】 BTXA；变应性鼻炎；鼻溢；VIP；大鼠0引

3、言1978年美国旧金山眼科研究所Scott医生将A型肉毒毒素(botulinum toxinA, BTXA)应用于斜视的治疗，取得良好疗效. 198912美国FDA正式批准BTXA为临床治疗药物，成为世界上第一个用于临床的微生物毒素. 1987年我国以王荫椿教授为首的生物制剂专家经10余年的潜心研究，继美国、英国之后，研制成功BTXA，1997年经国家卫生部审批通过，成为第一个微生物毒素注射治疗疾病的生物制剂新药. 根据BTXA不阻断神经兴奋的传导，而只作用于运动神经末梢的神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡上的一种膜蛋白，产生暂时性的神经递质的阻断和抑制突触前膜乙酰胆碱的释放，致使肌肉麻痹的作用原理.

4、 我们拟通过制作变应性鼻炎动物模型，观察BTXA对致敏动物鼻腔粘膜的影响，为临床治疗变应性鼻炎提供新途径及实验依据.1材料和方法1.1材料成年健康雌性Wistar大鼠16只，体质量200250 g，由兰州医学院实验动物中心提供. 微量移液器（梅特勒托利仪器有限公司）；电子天平（AR1140C型）；Olympus BH2型显微镜（日本）. 结晶型A型肉毒毒素（BTXA,50 U/A，兰州生物制品研究所提供）；卵清蛋白 (Ovalbumin, A5253 Sigma，美国) （华美生物制品有限公司）；氢氧化铝，上海化学试剂厂；VIP多克隆抗体（BA0126 效价1200）、SABC试剂盒（SA10

5、22）和DAB显色试剂盒（ED1022）均为博士德生物制品有限公司； 多聚甲醛（分析纯，上海溶剂厂）；枸橼酸三纳及枸橼酸（分析纯，沈阳化工试剂厂）.1.2方法L-1卵清蛋白10 L用微量移液器滴鼻，每日1次，共7次.L-1水合氯醛（3 mLkg-1）麻醉下于右侧鼻腔内填入浸有BTXA（使用前以无菌生理盐水按比例稀释，10单位,0.1 mL）的棉条，放置1 h后取出. 对照组及致敏组动物均在同样麻醉条件下，于右侧鼻腔内填入浸有生理盐水的棉条（剂量同BTXA组）. 同样放置1 h后取出. 自给药后第2日起每2日给致敏组及BTXA用药组大鼠鼻腔滴入100 gL-1卵清蛋白10 L激发1次，观察症状和

6、体征.作者：文卫东 侯一平 袁芳 王荫椿 宋焱峰 【关键词】BTXInhibition of rhinorrhea with botulinum toxin type 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。L-1水合氯醛（4 mLkg-1）全身麻醉，开胸经左心室插管至主动脉进行灌注，先用100 mL生理盐水冲净血液,再后续40 gL-1多聚甲醛0.1 molL-1 PBS (pH 7.4) 500 mL灌注固定. 取右侧鼻呼吸区粘膜并置于上述固定液

7、中后固定24 h. 组织学及免疫组织化学准备, 取右侧鼻呼吸区粘膜依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋后，石蜡切片机（AO820型，美国）切片，片厚4 m；切片贴于涂有多聚赖氨酸（Sigma，美国）的载玻片上，置于4冰箱保存备用. 每组隔片取样5张，分别进行染色及免疫组化检测. 血管活性肠肽VIP免疫组化检测采用抗生物素生物素过氧化物酶复合物法（SABC法）. 染色程序：切片脱蜡至水. 滴加新鲜配制的30 mLL-1过氧化氢液，室温（20）10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗2 min3次. 滴加复合消化液510 min. 蒸馏水洗3次. 滴加正常山羊血清封闭液，37孵育20 min, 不洗，甩干.

8、 兔抗 VIP多克隆抗体，4过夜，10 mmolL-1PBS漂洗3 min3次. 滴加羊抗兔 IgG，37孵育20 min，10 mmolL-1PBS漂洗min3次. 滴加SABC，37孵育20 min，10 mmolL-1PBS漂洗5 min4次，DAB显色：取1 mL蒸馏水，分别加入试剂盒中A,B，C试剂各1滴，混匀后加至标本片上，镜下控制显色时间，双蒸水终止反应. 苏木素轻度复染，脱水、透明、封片. 光镜下观察，Olympus BH2型显微镜摄片. 对照组以正常兔血清代替一抗，其余步骤同上.统计学处理: 所有数据均应用SPSS 10.0软件进行统计学处理. 结果以xs表示. 采用重复测量

9、资料的方差分析进行数据处理.2结果2.1症状和体征对照组鼻液分泌量无明显变化，少量为清水涕，喷嚏及抓痒次数无增多，鼻周皮肤无红肿. 卵清蛋白致敏后，鼻液明显增加，多为清水涕，喷嚏及抓痒次数增多，鼻周皮肤红肿. 致敏加BTXA组，鼻分泌量明显减少，喷嚏及抓痒次数减少，鼻周皮肤红肿减轻. 用药后第1日，致敏加BTXA组动物鼻分泌量减少，与致敏组相比差异有显著性(P0.05). 至用药第3日致敏加BTXA组动物鼻分泌量明显减少，与致敏组相比有显著差异（P0.05）. 致敏加BTXA处理后第1，3，5和7日组间效应显著(P0.05). 鼻分泌量第7日降至最低点，遂进入平台期，第9日致敏加BTXA组与致

10、敏组相比差异显著(P0.05, Tab 1).表13组动物卵清蛋白激发后不同时间鼻分泌量的变化(略)2.2喷嚏及鼻痒症状的改变对照组鼻喷嚏及抓痒次数无增多，鼻周皮肤无红肿. 卵清蛋白致敏后，致敏组鼻液明显增加，多为清水涕，喷嚏及抓痒次数增多，鼻周皮肤红肿. 致敏加BTXA组，鼻分泌量明显减少，喷嚏及抓痒次数较致敏组无明显变化，鼻周皮肤红肿减轻. 鼻痒及喷嚏症状在BTXA用药前后无明显变化.2.3组织病理学改变对照组鼻粘膜上皮层完整，固有层可见腺细胞、腺管以及毛细血管，未见炎性细胞浸润. 致敏组上皮层不完整，固有层内有腺体大量增生，可见散在分布的以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润. 致敏加BTXA

11、组上皮结构基本完整，腺泡细胞减少，腺管细胞胞质疏松，轻度萎缩（Fig 13）.2.4VIP物质免疫组化免疫组化染色发现对照组鼻粘膜可见有少量VIPIR纤维散在分布于上皮与细胞间，在小静脉周围可见VIPIR纤维. 致敏组鼻粘膜腺管细胞胞质呈VIP免疫反应阳性，染色深. 致敏加BTXA组腺管周围未见VIPIR纤维，腺管上皮细胞VIP染色明显减弱（Fig 46）.图1图6(略)3讨论神经肽（NP）1-3与变应性鼻炎4 (allergic rhinitis， AR)的关系是近年鼻科学研究的重点之一，近年来的研究加深了对鼻粘膜神经末稍分布规律及NP参与AR机制的认识. 迄今已在人及啮齿类动物的鼻腔发现并

12、定位了数种NP. 拟副交感性神经肽以血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)为代表，主由副交感神经节后纤维所释放，并与乙酰胆碱（Ach）共存（colocalization）. NP在炎症反应的不同阶段及不同解剖位点发生作用，但总的作用效果是扩张动脉、增加血管通透性、促进浆液腺和粘液腺的分泌.AR发病机制与感觉神经中无髓C型感觉神经传入纤维的高敏感性有关，变应原物质进入鼻腔后刺激鼻粘膜引起感觉神经末梢大量释放神经递质，如P物质、VIP及降钙素基因相关肽(calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)等，从而导致血浆蛋白渗

13、出，而且腺体分泌增加形成神经原性炎症并诱发喷嚏反应.肉毒毒素A是肉毒梭菌产生的一种高分子蛋白的神经毒素，引起人和动物肉毒中毒，死亡率很高. 肉毒中毒的松弛性麻痹，是由毒素对周围神经，特别是胆碱能神经的作用引起的，作用部位是胆碱能运动神经末梢5-8. 由于发现中毒机体的神经仍能传导正常冲动，而它的效应器在直接刺激时仍能收缩，所以认为毒素是作用于神经肌肉的接点，即突触处，作用在突触前膜，而不是突触后的效应器肌肉上. 肉毒毒素的作用过程包括三个不连续的阶段：第一阶段结合阶段. 毒素结合于神经末梢表面受体，结合是快速的，基本上是可逆的，属于细胞外的，抗毒素此时仍能对它起作用. 第二阶段定位阶段，毒素本

14、身或其一部分进入神经膜，即离开了抗毒素能接近的部位，这称为毒素的内转(internalization). 这种内转是逐步的、有限的，虽然机制不详，但认为它不是一种被动的扩散，而是一种主动的过程，也许是吸附性胞饮现象，也许是蛋白载体或通道的形成. 第三作用过程麻痹阶段. 这是最重的阶段，由此而发生麻痹过程. 毒素一旦结合于神经内面，囊泡就不再与神经膜融合而释放它所储存的乙酰胆碱. 如盐酸胍和4氨基吡啉都是通过钙离子的作用而奏效的，而肉毒毒素将以一种酶击（enzymatic attack）的形式对钙促进介质释放进行限制. 钙能促进介质的释放，达到对抗和缓解肉毒毒素的作用，抑制乙酰胆碱释放的药物由于

15、毒素作用于神经末梢，对抗Ca2 触发的乙酰胆碱的释放过程，抑制神经介质乙酰胆碱的同时，也抑制拟副交感性神经肽VIP释放，从而导致血浆蛋白渗出减少，使鼻分泌量症状明显减轻9-11.作者：文卫东 侯一平 袁芳 王荫椿 宋焱峰 【关键词】BTXInhibition of rhinorrhea with botulinum toxin type 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。本研究用卵清蛋白建立大鼠AR模型12-16， BTXA滴注过敏鼻腔抑制释放

16、鼻神经肽，鼻粘膜VIP的免疫组化表达及BTXA是具有抑制VIP减少鼻溢，结果表明肉毒毒素具有明显抑制或消除AR临床表现的作用，使鼻分泌量症状明显减轻. 组织学显示，经肉毒毒素处理后，炎性细胞明显减少，粘膜结构恢复正常，VIPIR纤维密度和数量减少，表明VIP通过抑制感觉神经超敏性，而使过强的免疫反应恢复至基本正常状态. 研究表明，VIPIR纤维在AR发病机制中具有重作用. BTXA对大鼠AR治疗过程，在减轻AR鼻溢的同时，VIP释放减少. 而达到治疗AR的作用.【参考文献】1 Fang SY, Shen CL, Ohyama M. Distribution and quantity of ne

17、uroendocrine markers in allergic rhinitis J. Acta Otolaryngol, 1998; 118(3): 398-403.2 Fang SY, Shen CL. Neuropeptide innervation and neuroendocrine cells in allergic rhinitis and chronic hypertrophic rhinitis J. Clin Experimental Allergy, 1998; 28(2): 228-232.3 Rosenwasser LJ. Treatment of allergic

18、 rhinitis J. Am J Med, 2002; 16(113 Suppl 9A): S17-S24.4 Bousquet J. Allergic rhinitis as a global health problem J. ACI Int, 200l; 13:13.5 Naumann MK, Lowe NJ. Effect of botulinum toxin type A on quality of lifemeasures in patients with excessive axillary sweating: A randomized controlled trial J.

19、Br J Dermatol, 2002; 147(6): 1218-1226.6 Suskind DL, Tilton A. Clinical study of botulinumA toxin in the treatment of sialorrhea in children with cerebral palsy J. Laryngoscope, 2002; 112(1): 73-81.7 Sloop RR, Cole D, Patel MC. Muscle paralysis produced by botulinum toxin type A injection in treated

20、 torticollis patients compared with toxin naive individuals J. Mov Disord, 2001; 16(1): 100-105.8 Ragona RM, Blotta P, Pastore A. Management of parotid sialocele with botulinum toxin J. Laryngoscope, 1999; 109:1344.9 Ellies M, Laskawi R, Tormahlen G, Gotz W. The effect of local injection of botulinu

21、m toxin A on the parotid gland of the rat: An immunohistochemical and morphometric study J. J Oral Maxillofac Surg, 2000; 58:1251-1256.10 Ellies M, Laskawi R, Gotz W. Arglebe C, Tormahlen G. Immunohistochemical and morphometric investigations of the influence of botwlinwm toxin on the submandibular

22、gland of the rat J. Eur Arch Oforhinolaryngol, 1999; 256:148.11 Buar Ko. Siarrhea in amyrphc lateal sclerosis: A hypothesis of a new treatment botulinum toxin A injections of the parotid glands J. Med Hypotheses, 1997; 48:337.12 Hang FY, Han DM, Zhu XN, Wan H, Huang MZ, Zhang XM. Immunohistochemical and pathological study of capsaicin in the treatment of rabbit animal model with allergic rhinitis J. Zhonghua Erbiyanhouke Zazhi (Chin J Otorhinolaryngol), 1999; 34 (