玉米叶色突变的研究概况

1、玉米叶色突变的研究概况玉米是世界上广泛种植的产量最大的作物，它不仅是粮食，饲料的重要来源，也是工业酒精和烧酒的主要原料，由于其广泛的用途使玉米在世界的农业生产中占有重要的地位(陈彦惠，1996)，玉米产量的持续提高对保持粮食安全有重要的意义。高产性状包括协调的源(叶)库(籽粒)关系、合理的株型、优良的产量因素组成(亩株数、穗粒数、粒重)和高光效等四个部分组成。叶色突变往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，对叶色突变体的深入研究，对阐明光合作用调控机理和利用基因工程提高作物的光合效率，进而增加作物的产量具有重要的理论意义。11玉米基因组学研究1986年美国科学家Thomas Roderick提

2、出了基因组学(Genomics)，指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics)，又被称为后基因组(postgenome)研究。随着结构基因组学的发展，比较基因组学(Comparative Genomics)也快速发展起来。111玉米结构基因组研究结构基因组学(structural genomics)是基因组学的一个重要组成部分和研究领

3、域，它是一门通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。染色体不能直接用来测序，必须将基因组这一巨大的研究对象进行分解，使之成为较易操作的小的结构区域，这个过程就是基因作图。根据使用的标志和手段不同，作图有三种类型，即构建生物体基因组高分辨率的遗传图、物理图谱、转录本图。因此结构基因组学研究内容主要包括以下几个层面： 遗传图谱：利用各种DNA多态性，如RFLP、AFLP、SSR、RAPD等分子标记手段，通过计算遗传标记之间的重组频率，建立遗传连锁图谱；物理图谱：通过构建全基因组YAC、BAC、粘粒文库等，采用如EST、STS等标记手段，根据文库克隆之间重叠序列确定片断间的连接顺序

4、和遗传标记间的物理距离； 序列图谱：根据物理图谱将基因组分为若干具有标识的区域进行测序分析，在同一区域内需要利用DNA片断重叠群使测序工作得以不断延伸或采取全基因组鸟枪法等策略，直至完成全基因组测序(赵晋平，2006岳思君，2005田清震，2006)。1111分子标记的研究进展分子标记有广义和狭义之分，广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段又称DNA标记。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相

5、比，DNA分子标记具有更大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记根据其技术基础，大致可分为三大类，第一类是基于DNA杂交技术的分子标记，如RFLP(限制性片段长度多态性)标记(Grozdicker等，1974)；第

6、二类是基于PCR技术的分子标记，如SSR(简单序列重复)标记(Hamade等，1982)、RAPD(随机扩增多态性DNA)标记(Wiliams等，1990)、AFLP(扩增片段长度多态性)标记(Zabeau等，1993)、ISSR(简单重复间序列)标记(Zitkiewicz等，1994)；第三类是基于已知序列的新型分子标记，如SRAP(相关序列扩增多态性)标记(Li等，2001)、TRAP(靶位区域扩增多态性)标记(I-Iu等，2003)、SNP(单个核苷酸多态性)标记。1.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)197

7、4年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA-_DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因

8、型间限制性片段长度的差异。2.简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)是指在真核生物基因组中分布着由24个碱基对组成的简单重复序列，又称微卫星DNA其中最常见是双核昔酸重复，即(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目1060个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR序列的侧翼具有保守的DNA序列

9、，其多态性明显高于RFLP及其它分子标记，且操作简便快速，表现为共显性和孟德尔遗传，在基因组中分布趋于随机。它以高度的多态性信息量和PCR技术的方便性使其表现出更大的优势，人们把用SSR标记建立的连锁图称为继RFLP连锁图谱之后的第二代遗传图谱，在作物中利用已测序的EST序列，BAC序列，BAC末端序列寻找重复序列，通过侧翼保守序列设计引物，开发SSR标记，被广泛的应用于基因的精细定位。目前SSR标记已被广泛用于资源鉴定、连锁图谱绘制及目标性状基因的标记等研究上。3.核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别

10、核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每1000 bp SNP出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术。SNP被称为第三代DNA分子标记技术，随着DNA芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技术。Ching等研究了美国有代表性的36个玉米优良自交系，发现在基因组的非编码区中平均每31个碱基就有一个SNP差异，在非编码区还有高频率的插入和缺失，平均每85个碱基就有一个这样的差异。Tenaillon和Rafalski报

11、道在玉米平均104bp就有一个SNPs，其差异的水平比人类和果蝇都要高的多：基因的3端非翻译区和编码区分别有每48个碱基和130个碱基就有一个SNP差异。1112玉米遗传连锁图谱构建以遗传距离表示基因组内基因座相对位置的图谱，称为基因组的遗传图谱。遗传距离是指细胞在减数分裂过程中两个基因座发生交换的频率，单位是厘摩尔(centi-Morgan，cM)。当两个基因座之间发生1的重组率时，其遗传距离大约为1个cM。检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析、利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记

12、的遗传连锁图谱。利用分子标记构建遗传连锁图谱，在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。主要步骤包括：选择合适的亲本，并构建适宜的作图群体；选择适合作图的DNA标记：测定作图分离群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图谱。1.选择合适的作图群体玉米上常见的作图群体有初级群体(F2，BCl，RIL，硼等)，次级群体(NILs，ILs，CSSLs等)和高级群体(SSSL等)(席章营，2005)。F2群体：作为初级作图群体，及其衍生的F2：3家系群体属于临时性分离群体，显著特征是群体中的每个个体及其后代均可发生分离。F2群体易配制，且提供的遗传分析信息最为丰富，在凹

13、L作图中可以同时估计加性效应和显性效应。回交(BC)群体：每一分离基因座的两种基因型直接反映了F1代配子的分离比例，因而作图效率最高。回交群体与F2群体相比，同源染色体间重组交换机率减少12，因此所提供的信息量只有F2的一半。同时回交群体也是临时性群体，容易获得。重组自交系(Recombinant inbred 1ines，RIL)群体：作为初级作图群体，又属于永久性分离群体。RIL群体是杂种后代经过连续多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2单株采用单粒传方法建立起来。RIL群体由于在连续自交过程中染色体配对和重组增加，因而可以更精确地定位那些紧密连锁的位点，QTL作图比F2分辩率要高(Bu

14、rr B，Burr FA，1991)。RIL群体每个株系都是纯合的，是一种可以长期使用的永久性分离群体，可满足不同时间、不同研究者使用，有利于提高遗传图谱的密度和QTL定位的准确性。但建立这种群体需要花费较长时间，如玉米要建立完全纯合的RIL作图群体，至少需要自交15代(吴为人等，1997)。实践中，人们选用自交6-7代的“准”RIL群体来构建分子标记连锁图谱也是可行的。1.构建遗传连锁图以遗传距离表示基因组内基因座相对位置的图谱，称为基因组的遗传图谱。遗传距离是指细胞在减数分裂过程中两个基因座发生交换的频率，单位是厘摩尔(centi-Morgan，cM)。当两个基因座之间发生1的重组率时，其

15、遗传距离大约为1个cM。遗传图谱的构建是基因定位的第一步，是基因克隆、基因组结构与功能研究的基础。遗传图谱的构建一般采用形态标记、细胞学标记、蛋白质标记和DNA分子标记等4种遗传标记。上世纪80年代以前主要采用前三种遗传标记，所构建的遗传图谱也称经典遗传图谱。经典遗传图谱的构建在理论上进一步证实了基因在染色体上呈直线排列的染色体遗传理论，在方法和原理上对后来的分子标记连锁遗传图谱的构建具有重要的指导意义，在实践上对遗传育种工作起到了很大的推动作用。进入20世纪80年代后，分子标记得以广泛开发和应用，如RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP，具有数量丰富、遗传稳定、不受基因表达与否的限制、

16、不受环境影响以及共显性的特点，是在DNA水平上对遗传变异的直接反映，从而促进遗传图谱的构建由经典遗传图谱时期发展到以DNA分子标记为主的遗传图谱时期，促进了遗传图谱向高精确度和高分辩率迅速发展，为遗传图谱的构建及其应用建立了一个新的里程碑。此外分子生物学和基因克隆技术的发展，使得大量基因和cDNA片段被克隆分离，进一步为遗传图谱的构建提供了丰富的材料。早在1935年，Emerson等构建了包含62个形态学标记的遗传图谱，这是玉米的第一张遗传图谱。1986年，Helentjaris利用H427与761的F2群体构建了首张RFLP遗传图谱，定位了117个遗传位点，分布于20多个连锁群。1989年，

17、Webber和Helentjaris利用RFLP标记分析了BA异位系与自交系杂交的后代，从而将细胞学图谱和遗传图谱联系起来。1991年Beavis和Grant利用4个不同的F2群体分别构建了RFLP图谱，并且4个群体的数据构建了一张整合的连锁图谱，他们发现虽然有些标记间的遗传距离在不同的群体中表现出了显著的差异，但在标记的排序上没有统计学意义上的不同，此外他们讨论整合不同群体的数据，构建连锁图谱时存在的一些潜在问题，这为构建高密度的玉米整合遗传图谱打下了基础。1993年Gardiner等利用TX303与C0159的一个永久F2群体构建了覆盖整个玉米基因组的RFLP标记连锁图谱，其中包含了215

18、个遗传位点，并且从十个连锁群中选择了单拷贝的、多态性高的、相邻标记的间距不大于30CM的97个RFLP标记作为核心标记，将玉米基因组划分为110个bin区。1999年Castiglioni等利用AFLP技术饱和玉米的RFLP连锁图谱，在原来的RFLP连锁图谱上增加了246个AFLP覆盖玉米基因组2057cM。同年Vuylsteke等利用B73与M017的重组自交系群体，D32与D145的F2群体分别构建了高密度的玉米标记连锁图谱，利用B73与M017重组自交系群体图谱中包含了1723个分子标记，其中AFLP标记1529个，RFLP、SSR标记和同工酶标记184个，在用D32与D145的F2群体

19、构建的连锁图谱中有1402个分子标记，包括AFLP标记1355个，RFLP和SSR标记47个。Davis等利用B73与M017的随机交配群体构建了含有多个1850个标记的连锁图谱。2002年，Lee M等开发了1051个新的SSR标记，并结合IBM群体、TX303与C0159的永久F2群体和T218与GTll9的永久F2群体，构建了三张新的图谱。由于SSR在玉米中存在的广泛性和技术上的便捷性，现已开发出了大量的SSR，被广泛用于遗传图谱构建，仅MMP计划在很短的时间内就开发出了2000多个SSR。在玉米基因组数据库中现已经收集了300多张玉米的图谱，可供研究人员参考。1114玉米的物理图谱和全

20、基因组测序随着分子生物学的发展，分子标记图谱的饱和，玉米基因组研究正向着物理图谱构建，物理图谱与遗传图谱整合和全基因组测序的方向进行。物理图谱是反映生物基因组中基因或标记间的实际距离的图谱，其图距单位通常为Kb或Mb。遗传图谱上揭示的遗传距离是一个相对数值，遗传图距与同位点之间的实际物理距离存在差异，不同物种间差别很大，如水稻1CM平均相当于191Kb而玉米和大麦lCM分别相当于1136kb和3471kb。早在2002年就开始了玉米基因组的初步测序工作，初步确定了玉米的基因数量和它们的相对位置。玉米基因组的大小约为2,500Mb，与人类相当，为拟南芥的20倍，水稻的6倍，大约包含50000个基

21、因，基因数目约为水稻的1.5倍，通过Arumuganathan等分析得出每l00kb范围内含有0.5到10.7基因。由于玉米基因组较为庞大且含有大量的重复序列(占玉米基因组的60-80)，致使玉米基因组学的研究落后于拟南芥和水稻，对玉米基因组学的研究大多还停留在结构基因组学阶段。112玉米功能基因组的研究全基因组序列的公布标志着玉米基因组学的研究进入了功能基因组学(functionalgenomics)时代，也称为后基因组学(postgenomics)时代。它主要是利用结构基因组学提供的序列信息，在基因组水平上阐明全部基因的位置、结构、功能和调控方式以及生理代谢机制。1图位克隆(map-bas

22、ed cloning)方法研究基因功能图位克隆又称定位克隆(positional cloning)，1986年首先由剑桥大学的Alancoulson提出，是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库(包括YAC、BAC、TAC、PAC或Cosmid文库)，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步查(chromosome walking)逐步逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)的方法最终找到包含该目的基因的克隆(Tanksley S D，1995)

23、，并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。而且，随着各种植物的高密度遗传图谱和物理图谱的相继构建成功，图位克隆技术在植物的基因克隆中有着更广阔的应用前景。 图位克隆技术主要包括4个基本技术环节：目的基因的初步定位：精细定位：构建目的基因区域的物理图谱和精细物理图谱直至鉴定出包含目的基因的一个较小的基因组片段：筛选cDNA文库并通过遗传转化试验证实所获目的基因的功能和序列分析。自1992年图位克隆技术首先应用在拟南芥(Arabidopsis thal iana)上成功分离ABl3基因(Giraudat J，1992)和FAD3基因(Arondel V，1992)以来，已有三十多个植物基因用此技术成

24、功克隆(景润春，2000；)。随着近年来，玉米基因组测序的快速发展，在玉米上运用图位克隆技术将有广阔的发展前景。113比较基因组学研究比较基因组学(Comparative Genomics)是利用某些基因组图谱和测序获得的信息，推测其他生物基因组的基因数目、位置、功能、表达机制和物种进化的学科。比较基因组学的发展与序列数据的积累密切相关，目前该学科已经成为研究生物基因组的最主要手段之一。利用FASTA、BLAST和CLUSTAL w等序列比对工具，种间的比较基因组学能够让人们了解物种间在基因组结构上的差异，发现基因的功能、物种的进化关系，以及进行功能基因的克隆。种内的比较基因组学研究主要涉及个

25、体或群体基因组内诸如SNP、IDP等变异和多态现象。比较基因组学的研究结果不但有助于深入了解生命体的遗传机制，也有助于阐明人类复杂疾病的致病机制，揭示生命的本质规律。第一张比较遗传图谱发表于1995年，该图把7种禾谷类作物的遗传图谱用圆形进行对应整合，以水稻连锁区段(rice linkageblock，RLB)为单位。这张图谱目前仍在进一步精细化。英国JohnInnes研究中心开发出了一个专门软件进行这方面工作。目前的比较遗传图谱已可用于快速构建其它禾谷类作物种的连锁图，并用它预测一些关键基因的染色体位置。比较基因组学的研究，为研究作物进化和重要基因的定位提供了方便。12高等植物叶色基因的分子

26、机制研究叶色变异是比较常见的突变性状，一般在苗期表达，但少数突变体直到生育后期才发生叶色突变。由于突变基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变体也称为叶绿素突变体。叶绿体是绿色植物进行光合作用的重要场所，而叶绿素是叶绿体中进行光合作用的光受体，光合作用是维持地球上生命活动的最根本的反应。因此研究植物叶色突变体是研究与叶绿素合成与调控相关基因功能的快速有效途径，同时通过对叶色突变体的深入研究为阐明作物的光合作用机制进而提高光合效率奠定基础。121植物光合色素代谢相关基因的研究进展光合生物在光合作用反应中吸收光能的色素称为光合色素， 光合作用的原初光物理过程就起始于

27、太阳能被光合色素吸收。光合色素主要有三种类型：叶绿素(包括细菌叶绿素)、类胡萝卜素和藻胆素，其中叶绿素是光合器官中最典型的色素。植物和绿藻中的叶绿素主要是叶绿素a和叶绿素b两种。大量的研究表明， 叶绿素合成是一个复杂的酶促生化反应过程，叶绿素合成通常分为四个阶段，第一阶段，谷氨酸(glutamicacid)转成氨基酮戊酸(ALA)，这个过程需要ATP和glu-tRNA合成酶的参与。然后由氨基酮戊酸合成胆色素原(porphobilinogen，PBG)，胆色素原是叶绿素的卟啉结构的组成单位。第二阶段，由4分子的PBG组装成卟啉结构(porphyrin structure)经过六种不同的酶促反应最

28、终形成原卟啉Ix(protoporphyrin IX)。第三阶段：原卟啉Ix经过酶促反应合成变成叶绿素酸酯(chlorophyllide 8)。第四阶段叶绿素酸酯chlorophyllide 8合成chlorophyll a。叶绿素a(chlorophyll a)经过叶绿素a氧化酶(chlorophyll a oxidase)可以形成叶绿素b(chlorophyll b)。在这个复杂的反应过程中任何相关基因的突变将使酶的活力降低甚至完全丧失，从而导致叶绿素合成受阻，表现出不同程度的叶色突变。122玉米中叶色突变基因的定位对于玉米叶色突变的研究开始较早，并取得了大量的成就，目前在玉米数据库中，已

29、经定位的叶色突变基因为134个，在玉米的每条染色体上分布的都有，玉米叶色突变的类型很多，但总的可以归纳成以下几类，即白化苗、白条纹、斑点叶、斑马叶、淡绿叶、黄条纹、绿条纹、细条纹这八种类型。在玉米数据库中，已经报道的与白化苗位点有关的基因为12个，白条纹有关的位点有8个，斑点叶的基因的22个，斑马叶基因有8个，淡绿色基因的72个，黄条纹基因有5个，绿条纹基因有6个，细条纹基因有1个。参考文献1陈彦惠，李玉玲等玉米遗传育种学口咽河南科学技术出版社，1996：l-32戴景瑞我国玉米遗传育种的回顾与展望J】玉米遗传育种国际学术讨论会文集，长春，2000.北京：中国农业出版社，2000，1-73冯英水稻DH群体的构建与微卫星标记分析【D】浙江大学博士学位