Sepacore应用培训-NJ

1、20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 1/26中压制备色谱和应用技巧中压制备色谱和应用技巧20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 2/26色谱分离的机理色谱分离的机理流动相（流动相（Mobile Phase）固定相（固定相（Stationary Phase）样品（溶解于流动相中的溶质）样品（溶解于流动相中的溶质）20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 3/2621437658酸性角（质子给予）碱性角（质子接受）偶极角（偶极作用）溶剂选择性

2、分类三角形图溶剂选择性分类三角形图展开剂的选择1 ：甲乙醚、乙醚2 ：甲醇、乙醇3 ：DMF、THF4 ：乙二醇、乙酸5：CH2Cl2、二氯乙烷6 ：乙酸乙酯、乙腈7 ：芳烃、芳醚8 ：三氯甲烷、水20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 4/26DCMMEKEtOHEtOH 7Hex 3MEK 9H2O 15:5Give upGive upEA20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 5/26常用（常用（TLCTLC）的展开方法）的展开方法一般用EA：PE(1：16；1：8；1：6；1：2；1

3、：1；2：1；3：1；1：0)对于在EA/PE里不溶解的化合物，可以用CH2Cl2代替以上的PE，但是EA的用量必须减半才能到达同样的Rf值。极性较大的化合物：MeOH：CH2Cl2(2.5：100；5：:100；10：100).MeOH量一般不超过10%，否则SiO2会溶解的。碱性化合物：NH4OH：MeOH：CH2Cl2(0.5：5：100；0.5：10：100).NH4OH是浓氨水。最好先混合NH4OH和MeOH，再加CH2Cl2。酸性化合物：AcOH：MeOH：CH2Cl2(1：5：100；1：10：100)极性非常大的的化合物：H2O：AcOH：MeOH：CH2Cl2(1：2.5：2

4、0：100)。这个条件什都能展开！但只适合于TLC。在SiO2柱上会溶解SiO2的。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 6/26装柱装柱装柱一般分为干法装填和湿法装填，总的原则是装填结实、高度适中、表面平整。 密度：不结实影响柱效 高度：15cm，长则扩散或拖尾，短柱效低 表面：平整，不平样品走不平干法装填：简便，易产生气泡湿法装填：无气泡，装填时阻力大中压色谱系统所用硅胶相对粒径较细，一般采用干法装填。硅胶一定要填结实、平整；一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。反相填料采用一般湿法装填，待在

5、甲醇中超声脱气后，再装填结实平整即可。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 7/26上样上样干法：样品拌在硅胶中，铺在填料的表面。低沸点溶剂中硅胶的质量 是样品质量的1.2-1.5倍，旋干后，不能看到明显的固体颗粒。湿法：将液体或溶液样品直接加在填料的表面。且对于液体样品或 粘稠状半固体样品只能采用湿法上样。干法或湿法装柱都要求尽可能薄的平铺在硅胶上，太厚会造成分离效果差或分不开样品。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 8/26推荐上样量推荐上样量20140918_SepcoreBOL

6、IFor internal use onlypage 9/26流动相选择流动相选择由于流动相对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂 的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂

7、质的存在，将使截止波长值增加50-100nm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 10/2623110%B100%5%CVCartridge: FLASH 12+S (12 x 75 mm)Eluent:A) HexaneB) EtOAc Gradient:Linear, 5%B to 100%B i

8、n 60 mL (10 CV)Flow rate:13 mL/minLoad:50 mg# CV:10LinearCartridge: FLASH 12+S (12 x 75 mm)Eluent:A) HexaneB) EtOAc Gradient:Step 1 - 20%B for 60 mLStep 2 - 75%B for 30 mLFlow rate:13 mL/minLoad:50 mg# CV:15231Step15Isocratic%B75%20%0%100%10CVStepCartridge:FLASH 12+S (12 x 75 mm)Eluent:Hexane/EtOAc

9、80:20, isocraticFlow rate:13 mL/minLoad:50 mg# CV:3023Legend1. 1-Nitronaphthalene2. 2-Nitroaniline3. 4-Nitroaniline1203010CVIsocratic洗脱方式洗脱方式20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 11/26 放大条件的摸索放大条件的摸索?20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 12/26放大 增加样品量 (1)20140918_SepcoreBOLIFor inter

10、nal use onlypage 13/26放大增加载样量 (2)20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 14/26放大 增加载样量 (3)装长柱比短柱困难通常长柱会因为样品扩散而峰扩散.短柱容易操作理论值:放大必须通过增加直径 !经验: 2x 直径 = 1.25 x 长度= 4 x 流速!20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 15/261 根正相柱柱串联6 根柱串联叠加20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 16/26Sepacore

11、中低压制备色谱中低压制备色谱- easily adjustable flow rates- up to 250 ml/min throughput- up to 50 bar pressure- gradient function for binary mixtures20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 17/26C-670 装柱器装柱器- 高度相似性用于重复分离.- 没有因运输，存储和老化造成的质量问题- 装柱过程无硅胶浪费 最多可节省50%的硅胶- 压力最大到 10 bar- 分离过程可视-固定相可用 30-200 m-不同的预装柱可

12、选择 4种塑料柱 1种玻璃柱两种加压方式20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 18/26C-601C-601紫紫 外外 检检 测测 器器可变波长二极管阵列 C-640: 190 to 840 nm四波长制备型检测器全波长扫描工作流速高达500mL/min性能稳定，结实耐用20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 19/26C-601C-601功能强大的自动馏分收集功能强大的自动馏分收集 可根据样品峰和流动相体积收集馏分 多种试管架可供选择： 内置9种试管架定义 用户可自定义11种试管架最大馏

13、分收集体积：12L 可选配废液瓶液味监测器无论是否配备检测器都可运行20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 20/26控制软件控制软件: Sepacore ControlSepacoreControl 控制步琦Sepacore色谱系统 可自动侦测系统硬件 方法设定简单直观；平衡、分离及洗柱方法 可自动连续执行 多柱间自动切换，实现连续分离功能 运行中可随时改变梯度设置 可设定收集的滞后体积，无需担心检测器与 收集器间的死体积 带硬件维护功能，方便查看所有硬件信息， 并实现手动控制20140918_SepcoreBOLIFor internal

14、 use onlypage 21/26正向硅胶柱砍段砍段中低压制备除色素，再砍段除色素，再砍段凝胶柱色谱除色素，再砍段除色素，再砍段制备薄层色谱高压制备液相半制备HPLC分离流程分离流程20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 22/26正向硅胶柱色谱正向硅胶柱色谱硅胶砍段：目前实验室有硅胶砍段：目前实验室有两种方案，一种是粗砍段，两种方案，一种是粗砍段，砍成砍成6个段，一个星期解决个段，一个星期解决（湿法和干法上柱）；（湿法和干法上柱）；一一种是细砍段，砍成每段种是细砍段，砍成每段2g左右，左右，20个段左右，持续个段左右，持续二个月左右，大

15、柱子下来二个月左右，大柱子下来可以分到可以分到89个化合物，之个化合物，之后不再上硅胶柱。后不再上硅胶柱。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 23/26中低压制备色谱中低压制备色谱摸条件摸条件：反向薄层板，反向薄层板，MeOH，80%，60%， 40%，20%(点样时要稀点样时要稀) 为了增加洗脱能力有时候加四氢呋喃为了增加洗脱能力有时候加四氢呋喃上样量上样量：小柱，小柱，10g以下以下, 大柱大柱, 10g以上以上流流 速：速： 小柱，小柱，6mL/min, 大柱大柱, 18mL/min梯度设置：梯度设置：30%-40%(1h), 40

16、%(1h), 40%-45%(1h), 45%(1h),.,MeOH, Me(CO)2点板合并：较多水，不好点板时，可以三个试管合并浓缩点板合并：较多水，不好点板时，可以三个试管合并浓缩后再点板后再点板20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 24/2620140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 25/26样品量大于样品量大于50mg时时, 23个点个点, 可以进行薄层制备可以进行薄层制备摸条件时摸条件时, 多试不同体系的展开剂，选出最优条件多试不同体系的展开剂，选出最优条件上样量每张板控制在上样量每张板控制在20mg, 点样要均匀点样要均匀, 样品吹干后方样品吹干后方可进行展开。万万不可跑过头！否则色带分散很严重可进行展开。万万不可跑过头！否则色带分散很严重!两个点两个点 Rf 值相邻较近时值相邻较近时, 可