碱性氨基酸调节PLGA体外降解特性的研究

1、碱性氨基酸调节PLGA 体外降解特性的研究王为1, 2, 蔡绍皙3, 李明晖3,5, 麻开旺3, 刘 彬3,5, 徐志玲3, 4, 杨 力3,4, 宋保罗4, 李校坤1,2, *1 吉林农业大学生物工程技术研究院, 长春, 1301182 温州医学院药学院, 温州, 3250273 重庆大学生物工程学院, 重庆, 4000304 重庆大学-UCSD 中美国际合作实验室, 重庆, 4000305 西南大学生命科学学院, 重庆, 400716摘要：目的：在体外下考察碱性氨基酸对聚乳酸-聚羟基乙醇酸共聚物降解后集酸程度的缓解能力。材料方法：将赖氨酸、组氨酸、精氨酸分别各按5%和10%的比例与PLGA

2、 制成复合物，于体外在37下在三蒸水中进行降解2个月；通过总体观察、降解液PH 的变化、复合物的失重率等指标来考察碱性氨基酸对PLGA 体外降解特性的调节作用，同时将碱性氨基酸的调节效果与海藻酸钠、壳聚糖、碳酸氢钠的进行对比。结果：各种碱性添加剂都有一定的缓解酸度的能力， NaHCO3的缓解能力最强，海藻酸钠和壳聚糖的缓解能力较低，而碱性氨基酸的缓解能力适中；赖氨酸为5%时的添加量时能够得到较佳的综合调节缓解效果。结论：碱性氨基酸能有效地缓解PLGA 降解后的集酸程度。关键词：PLGA ；降解；碱性氨基酸；酸度调节PLGA 是丙交酯和乙交酯的共聚物，由于其具有良好的生物相容性和生可物降解性而被

3、广泛地应用于组织工程和医用材料等领域1-5。PLGA 在生物体内首先通过酯键的水解而降解为乳酸和羟基乙酸，最终代谢为二氧化碳和水而被排出体外6-7。但是，PLGA 在降解中会产生酸性单体乳酸和乙醇酸而使组织局部集酸，从而引起肌体局部产生炎症反应8。目前已有报道通过磷酸氢二钠、生物玻璃、磷灰石等物质来对之进行改性以缓解或消除局部集酸的程度9，但还未见使用碱性氨基酸来调节PLGA 降解时的集酸程度的研究。本研究采用赖氨酸、组氨酸、精氨酸分别与PLGA 进行复合，考察它们对PLGA 降解时的集酸程度的调节功效，为解决PLGA 降解时的集酸程度的缓解途径提供一种实验依据。 1 材料与方法1.1 主要试

4、剂和仪器PLGA （80/20, Sigma）；赖氨酸、组氨酸、精氨酸（Sigma ，纯度99%）；壳聚糖（成都科龙化工试剂厂，脱乙酰度85%）；海藻酸钠（天津大茂化学试剂厂，粘度范围为1.051.15）；碳酸氢钠、二氯甲烷（重庆市东方试剂研究所，分析纯）；pH 计，电子天平，恒温孵箱，400目筛网，减压干燥机。1.2 样品的制作（1） 样品处理 用研钵将干燥的赖氨酸、组氨酸、精氨酸和海藻酸钠、壳聚糖、碳酸氢钠在干燥的环境下分别充分研细，然后分别过400目筛，收集筛出物并分别保存在干净的安瓿中后密封备用。（2） PLGA-二氯甲烷溶液的配制 将PLGA 溶解在二氯甲烷中以制备10%的PLGA-

5、二氯甲烷溶液，并密封保存备用。（3） 复合物膜的制备 将碱性氨基酸分别按5%和10%的2个比例分别添加到对应量的PLGA-二氯甲烷溶液中，将海藻酸钠、壳聚糖、碳酸氢钠各按10%的比例分别添加到PLGA 二氯甲烷溶液中，分散均匀后待溶剂二氯甲烷自然挥发干净即得到复合物膜，然后再减压干燥48 h以抽干溶剂即得最终的试样。各试样的配比如表1。表1 PLGA复合试样配比表 编号调节剂添加量 赖氨酸 赖氨酸组氨酸 组氨酸精氨酸精氨酸海藻酸钠壳聚糖 对照 碳酸氢钠1.3体外降解实验取按表1所制得的试样（厚0.40 mm，质量0.03 g），每种试样各称取质量相同的3份，不同种类的试样质量相同，以相同质量的

6、纯PLGA 试样为对照。然后将所取试样分别置于干净的安瓿中，每个安瓿各加入3 ml三蒸水，最后将安瓿放置在37的恒温孵箱中进行降解试验。实验中不更换降解液，在设定的时间点上进行相应指标的测定。1.4总体观察眼观试样在降解过程中的物理变化情况。1.5降解液PH 的变化在设定的时间点上用PH 计对每份降解液进行监测1.6试样失重率的变化将试件从玻璃瓶中取出滤干后再真空干燥12h 后，进行称重，然后计算失重率。失重率%=初始净质量终了净质量100% 初始净质量1.7数据处理求取相同种类的3份试样的平均PH 值作为该监测点下此试样的PH 值；求取相同种类的3份试样的平均初始质量的平均值作为该此试样的初

7、始质量，求取该试样的终了质量的平均值作为此试样的终了质量。 2 结果 2.1总体观察 各原始试样质地柔韧，表面平整；3周时试样柔韧性下降，质地变硬, 形状无明显变化；4周时形状无明显变化，但表面粗糙化；5周时质地变软变脆。随着降解时间的延长，试件表面均可见逐渐加重的侵蚀现象，孔洞逐渐增多、加深，孔洞局部性地连成片状；随着降解的进行，试样由致密变为疏松多孔。 2.2 碱性添加剂对PLGA 降解过程中pH 特性的影响 所考察的碱性添加剂与PLGA 进行复合后，它们分别对PLGA 降解时的PH 的影响情况如图1所示。从图1可见，对于纯的PLGA 物质，随着在纯水中降解时间的推移，降解液的PH 值逐渐

8、下降。不同种类的碱性添加剂与PLGA 复合后都能对PLGA 在降解过程中的PH 产生一定的影响，但效果各异；相同种类的碱性添加剂与PLGA 复合后，其对PLGA 在降解过程中的PH 的影响与添加百分比相关。其中添加剂为无机物碳酸氢钠时，其调节功效最明显，使得PLGA 的降解液的PH 值一直处于碱性状态；而添加剂为壳聚糖时，其调节功效相对较平稳缓慢，使得PLGA 的降解液的PH 值一直处于酸性状态和平稳下降趋势；而碱性氨基酸添加剂的功效则处于中间状态，先使PLGA 的降解液上调成碱性，然后再下调为酸性，使得PLGA 的降解液的PH 值保持在中性附近和缓地变化。添加量为5%His和10%His在对

9、PLGA 的降解液的pH 的影响差异不明显；而添加剂为精氨酸和赖氨酸时在高添加量下其对PLGA 的降解液的pH 值的影响比低添加量下的要明显些。对于赖氨酸为5%的添加量时，在试验考察期内，其使PLGA 的降解液的pH 值处在7.286.62间，效果相对较好。 图1 各复合物在恒温37纯水中降解时PH 随时间的变化注释：PLGA 对照样，纯PLGA ；10%NaHCO3-PLGA NaHCO 3PLGA=19；10%Lys-PLGA赖氨酸PLGA=19； 5%Lys-PLGA赖氨酸PLGA=0.59.5；10%His-PLGA组氨酸PLGA=19； 5%His-PLGA组氨酸PLGA=0.59.

10、5；10%Arg-PLGA精氨酸PLGA=19； 5%Arg-PLGA精氨酸PLGA=0.59.5；10%SAL-PLGA海藻酸钠PLGA=19； 10%Chi-PLGA壳聚糖PLGA=19；2.2 碱性添加剂对PLGA 降解过程中质量损失特性的影响所考察的碱性添加剂与PLGA 进行复合后，它们分别对PLGA 降解时的质量损失特性的影响情况如图2所示。 图2 各复合物在恒温37纯水中降解时质量损失随时间的变化从图2可见，所考察的所有试样中，随着降解时间的推移，都会有不同程度的质量损失。各试样在降解初期明显有不同程度的质量损失；在降解中期时，质量损失不明显；而在后期，质量损失又明显化。从图中可见

11、，除了壳聚糖与PLGA 复合后在降解过程中质量损失较慢较小外，其他所考察的添加剂成分与PLGA 复合后都有不程度地加快复合物在降解过程中时的质量损失。除Sal-PLGA 试样在第1周内质量损失不明显外，其余试样在第1周内质量均有明显的下降；添加剂的添加量越大，质量损失幅度越明显，质量损失幅度在10%左右变化；随着降解时间的推移，各试样的质量损失都随时间的推移而缓慢增大；在7周的考察期内，各试样的最终质量损失率在10%25%不等。3 讨论从总体观察来看，各PLGA 复合物试样在7周考察期内外形保持良好，与初始外观外形差别不大，并未出现散断、溶解等现象，表明各复合物具有较好的力学性能。具有适合的力

12、学性能是组织工程材料的一项重要指标10。这主要是由于PLGA 高聚物本性所致，它虽亲水但不溶解在水中，却可以被水解6-7。随着降解的不断继续， PLGA共聚物的大分子链上的酯键在水解作用下，发生不同程度和数量上的水解，使共聚物的分子量逐渐减小，内部结构遭到破坏，原始的结晶特性也发生变化，致使各PLGA 试样的质地、颜色、力学性能等发生了不同程度的改变；同时，由于水分子入浸到PLGA 的基体里，增强了包囊在PLGA 基体里的添加成分的自由度，它们随着PLGA 的降解而从PLGA 基体中不断地溶解或者扩散迁移出来，使得试样出现孔蚀现象，从此可以得出PLGA 对添加的成分具有缓释特性。蔡晴等11，王

13、身国等12，余斌等13对PLGA 做了体外降解试验后都发现，随着时间的推移，降解液的 pH值最终呈酸性，且酸度随降解程度的加深而增强。在本试验中，如图1所示，采用添加碱性物质来对PLGA 在降解过程中的酸度进行调节的情况来看，不同碱性添加剂的调节效果是有差别的，造成这样的差别可与这些碱性添加剂的水溶性相关。3种碱性氨基酸的水溶性为LysArgHis，等电点为ArgLysHis。从调节的效果来看，由于Arg 不仅碱性强，而且溶解性较好，所以会出现调节效果最强的情况，在初期由于爆释现象的存在，使得溶液呈碱性； Lys溶解性好，碱性较强，所以调节较好；His 由于碱性较弱且溶解性不好，所以在3种碱性

14、氨基酸中的调节效果最差。其余的3种碱性添加剂中，壳聚糖不溶于水和碱性溶液中，故在降解的初期，其不起到任何调节酸度的作用，使得其降解液的PH 值一开始就处于往酸性趋势；但其溶解于低浓度无机酸或某些有机酸，在稀酸中壳聚糖会缓慢水解，生成一种碱性多糖，所以对PLGA 的降解酸性产物有一定的调节作用14；海藻酸钠的溶解性较差且碱性较弱，所以对酸度的调节效果不很明显；碳酸氢钠的溶解性很好，碱性最强，所以调节效果很明显，使得PLGA 的降解液基本上处于碱性状态。从时间来看，复合物在降解五六周左右时出现了pH 加速变化的情况，这可能是由于PLGA 在这一阶段降解速度加快，产生的酸性残基增多，致使pH 值明显

15、下降。余斌等13报道PLGA 在体外降解的失重在56周出现了降解加快的情况，本次试验结果也证明了此点。从图2可以看出，PLGA 共聚物的体外降解表现为一个时间依赖性过程，降解初期重量下降很快，随后降解速度将有减缓的趋势15-16。PLGA 与液体环境接触后酯键在水分子作用下发生随机裂解。在第12周内所有试样的失重较为明显，随后失重减缓，后期时失重又出现加快。这可能是因为在初期，一方面是因为被PLGA 所包囊的添加剂存在爆释现象17致使质量损失明显，添加量也多，爆释量相应也越大，质量损失也就更明显；另一方面是PLGA 本来也在降解造成的；随后，随着降解的进行，PLGA 分子链经有大分子链断裂为小

16、分子链，固有粘滞性在下降但质量上却无多大的变化，故出现了质量损失减缓现象；随后再随着降解过程的继续，降解出来的PLGA 小分子链成分增多，固有粘性进一步下降，有些小残断释放出来，这时就出现了质量的明显损失和酸度明显增高，这与Haiyan Li18的研究结果相一致。将PLGA 在植入体内后，通过对PLGA 的生物相容性研究11表明，2周后在PLGA 试样周围的肌肉组织都产生了少量的点状淤血，植入物和组织界面有炎症细胞浸润，4周后，炎细胞开始减少。这主要是由于PLGA 在体内降解中间产物乳酸的累积使酸度增加，从而使得机体局部集酸而产生炎症反应，随后这些酸性物质被体内酸碱缓冲体系所中和，从而恢复正常

17、。从图1可见本试验前2周对酸度的缓解效果较为明显，在8.736.62之间，接近中性，尤其是5%Lys- PLGA、10%His-PLGA和5% His-PLGA的效果较好。从本体外纯水试验结果可见，碱性添加剂可以有效地缓解PLGA 在降解过程中出现的集酸现象，而人体的体液环境就是一个大的缓冲平衡体系，采用内外结合以双重缓解集酸程度，可以断定这样的结合更能有效地缓解PLGA 在植入宿主体内因局部集酸而导致炎症反应的严重程度。由于碱性氨基酸本来就是宿主肌体成分的主要成分之一，同时又能自行参与机体的新陈代谢，具有安全无毒性，从本试验结果来看，采用碱性氨基酸来作为缓解PLGA 降解时集酸程度的调节剂具

18、有安全有效的特性，且以赖氨酸的综合性能最好。4 结论3种碱性氨基酸赖氨酸、组氨酸、精氨酸能有效地缓解PLGA 降解时的集酸程度； 赖氨酸以5%的添加量能得到最佳的综合调节效果。参考文献1 Lin HR, Kuo CJ, Yang CY, Shaw SY, Wu YJ. Preparation of macroporous biodegradable PLGA scaffolds for cellattachment with the use of mixed salts as porogen additives. J Biomed Mater Res 2002;63:271279.2 Rube

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