科学仪器学第三章蛋白质组学及相关的仪器

1、From Tissues to Targets to.A Healthy Lifestyle 达的准确检测也是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。 寻找目标材料(组织、细胞、细胞器 (确认目标蛋白的所在位置Altra/ XL流式细胞仪/细胞计数/活度测定仪Cellomics全自动荧光显微分析系统/A2芯片系统组织、细胞、细胞器等的分级分离细胞/亚细胞/细胞器的分级分离/Allegra TT/Avanti J高效离心机/ Optima 超速离心机/ 淘洗离心机/ Biomek全自动液体加样器 目标蛋白的快速分离ProteomeLab PF-2D 目标蛋白快速分离系统目标蛋白的快速鉴定Proteo

2、meLab PA 800 目标蛋白快 速鉴定系统/质谱联用系统/P/ACE MDQ毛细管电泳系统/ DU 800 核酸/蛋白分析仪/ XL-A 蛋白质液体相互作用分析系/Biomek蛋白质自动结晶工作站目标蛋白的评价A2 蛋白芯片系统/Access 免疫化学发光分析 系统/软件解决方案/ 生物信息学疾病的诊断Access全自动免疫分析系统/诊断蛋白芯片Altra/ XL 流式细胞仪各种快速诊断试剂盒和试纸条第三节蛋白质组学研究的技术方法去除高丰度或无关蛋白Thiourea + Urea CHAPSTris buffer pH 8.5DTT Ampholytes提高蛋白质的EttanIPGpho

3、r IEF unitEttan DALT sixpH3pH10+-+-+-+-+-+-+-+-+-+2蛋白质组学蛋白质组学分析samplesSeparate by 2-D PAGE学Cy2-labeled internal standard Cy3-labeled control Cy5-labeled disease 仪器学学研仪器学研仪器学和分析检测的飞行时间质谱联4800 MALDI-TOF-TOF 科研仪器学蛋白质组学常见质谱科研仪器学蛋白质组学常见质谱科研仪器学蛋白质组学常见质谱学分离的酶解的蛋白质96/384位样品靶蛋白质组学肽质量指纹图谱科研蛋白质组学质量相匹配。蛋白质组学PMF

4、中的问题第一个问题:质量相近的多肽怎么处理?在现实的蛋白数据库中,多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近从而增加结由于无法预知一个电泳点上有多少蛋白质,700去除待测物中的杂质。QTRAPMS 2021.42数据检索和分析科研仪器学蛋白质组学pHt/min对肝线粒体全蛋白提取液的一维色谱分离蛋白质组学AUt/min一维色谱分离M2B3馏分的反相色谱分离图M2C8_21反相色谱馏分酶切液进行Micro LC-ESI-Ion Trap MSNano LC-ESI-Q/TOF MS 研 仪 器 学 intensity ZHANGYJ20031010BM2B3-18 100 科 蛋白质组学

5、 研 仪 1: TOF MS ES+ TIC 4.43e4 科 ZHANGYJ20031010BM2B3-18 100 蛋白质组学 5: TOF MSMS ES+ TIC 679 器 学 intensity % 0 ZHANGYJ20031010BM2B3-18 100 4: TOF MSMS ES+ TIC 752 % 0 ZHANGYJ20031010BM2B3-18 100 3: TOF MSMS ES+ TIC 7.60e3 % % 0 ZHANGYJ20031010BM2B3-18 100 2: TOF MSMS ES+ TIC 4.52e3 % 0 20.00 25.00 30.0

6、0 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 Time 85.00 t/min 0 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 Time 85.00 t/min M2B3_18反相色谱馏分酶切液的Nano LC-ESI-Q/TOF MS 一级质谱总离子流色谱图 M2B3_18反相色谱馏分酶切液的Nano LC-ESI-Q/TOF MS 二级质谱四通道总离子流色谱图 科 研 仪 器 学 intensity 蛋

7、白质组学 科 MASCOT 对数据进行检索 研 仪 器 学 蛋白质组学 m/Z M2B3_18反相色谱馏分酶切液中m/z为795肽段的Nano LC-ESI-Q/TOF MS 二级质谱的质谱图 科 研 学 蛋白质组学 第四节 蛋白质组学的应用与发展趋 仪 势（自学） 器 研 仪 器 学 科 蛋白质组学 (一在原核及简单真核生物的蛋白质组研究 方面 相对高等真核生物细胞的复杂蛋白质网 络，原核生物的研究通常相对简单，并可 为进一步研究真核生物蛋白质组提供一定 的模式。 16 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 l流感嗜血杆菌的蛋白质组学研究 研 仪 器 流感嗜血杆菌(Haemophilusi，inf

8、luenzae是第一个获得基 因组全序列的生物。瑞士的一个小组通过2D-PAGE研究 了流感嗜血杆菌的蛋白质组分，在pH 310鉴定了 约300个蛋白质组分，然后用有两个尿素浓度的麦黄酮 (tricine胶分离了很难分离到的500020000范围内的蛋白 质，还鉴定了其中的80种。另外用肝素亲和层析将碱性 蛋白质富集后，在pH 61l的范围内又鉴定了102个蛋白 质，其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体蛋白。华盛顿 大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆菌的303 个蛋白质斑点进行质谱分析，确定了263个蛋白质，其中 大部分是外膜蛋白，以及与能量代谢和大分子合成有关的 蛋白质。另外发现了几种

9、不能在基因组中找到对应序列的 蛋白质。大约22被鉴定的蛋白质表现出与预计不同的等 电点和分子质量，显示它们可能经过了翻译后加工。 学 科 蛋白质组学 2大肠杆菌的蛋白质组学研究 大肠杆菌全部4000多个基因的DNA序列已被测定，并由此 建立了蛋白质基因联合数据库，希望以此来回答以下几 方面的问题：所有编码基因的产物在双向图谱上的位 置；各种蛋白质的丰度；不同条件下各种蛋白质表达 水平及合成速率的变化；各种蛋白质在细胞内的定位； 某些蛋白质翻译后修饰的方式和水平。目前，大肠杆菌 的联合数据库大约包括1600个蛋白质斑点的数据，其中大 约400个已与大约350个基因相对应。对于这些蛋白质，这 个数

10、据库可以提供基因名称、蛋白质名称、E。C编 号、功能范畴、Swiss-Prot数据库编号、Genbank序列 号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向及一些生理信 息(如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度。 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 3致病微生物的蛋白质组学研究 研 仪 器 蛋白质组的一个重要引用是在阐明新抗生素作用机理上。 近十年来，用于临床的抗 生素几乎都是原有抗生素的衍 生物。目前这种状况有所改变，寻找作用于细菌内新靶点 的研究工作已经展开，找到了许多有效的抗菌化合物，但 遇到的困难是难于揭示新的化 合物作用靶点及其作用机 理。有时虽然在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失 活，但

11、 在体内是否有这种现象以及这是否是抗菌的主要 机制却全然未知，双向电泳分析为此提 供了一个有效的 手段。例如，在研究抑制核糖体类抗生素对细菌作用机制 时，对12种 作用于翻译过程的不同阶段和核糖体内不同 分子的抗生素加以考察，发现其中有8种诱 导冷休克反应 (cold-shock response的一系列蛋白质和4种诱导热休克反 应的一系列 蛋白质，因此预计新的作用于核糖体的化合 物也是诱导这两种反应，并且因此可推测大 肠杆菌对冷 热的反应发生于核糖体水平。 学 科 蛋白质组学 4酿酒酵母的蛋白质组学研究 利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作也早于蛋白质组概念的 提出。酿酒酵母 (Saccha

12、romyces cerevisiae基因组的完成及其蛋白质 数据库在互联网上的建立，大大 加速了这一工作。借助数据库的有 力推动，在双向电泳图谱上最明显的蛋白质斑点大部 分已得到鉴 定。 丹麦进行的一项研究计划分别作出野生型和基因系统缺失的缺陷型 酵母的双向蛋白 质图谱。初步的研究表明，缺失单一基因将导致的 结果并不只是缺乏此基因编码的蛋白 质，而是能导致其他一系列蛋 白质量的改变。单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组全 局性的变 化。大约20的酵母基因缺失是致死性的，另外80则不然，这是因 为机体 能通过调节蛋白质的表达来对抗这种内源性的变化。这种基 因缺失的研究可能会告诉我 们一些关于细胞内

13、蛋白质分子间相互“对 话”和“作用”的重要信息，如蛋白质间的物 理联系(这些蛋白质可能 会组成蛋白质复合物、信号传递途径，以帮助我们了解细胞是如何 构成及如何协同工作的。 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 (二在多细胞真核生物的蛋白质组 研究方面 研 仪 器 学 不仅仅在原核及简单真核生物的蛋白质组研究方面方面取 得了突破性的进展，在多 细胞真核生物的蛋白质组研究 方面，也取得了巨大的成绩。 1线虫的蛋白质组学研究 利用双向电泳技术，研究者对线虫(C。elegans进行 了蛋白质组分析，在 pI3.5-9和相对分子质量10000200 000的范围内可分辨2000个以上的蛋白质斑点， 然后利用

14、Edman微量测序技术对其中24个斑点进行分析，得到其中 12个蛋白质的N端序列。已测出的12个中有一个未能找到 与其匹配的基因，另外11个与能量代谢、酸性核蛋白、G 蛋白等对应。C。elegans的19 000个基因已于1998年12月 全部测出，预计会对蛋白质组的研究提供帮助。 科 蛋白质组学 2果蝇的蛋白质组学研究 不同性别果蝇(Drosophila melanogaster 成虫的头、胸、腹部的蛋白质组图谱已分 别被作出，共约有1200个蛋白质被检出， 其中的大多数在头、胸、腹中是相同的， 但也发现了一部分其部位、性别特异的蛋 白质。 17 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 3人类的蛋白

15、质组学研究 研 仪 器 学 科 蛋白质组学 人类的蛋白质组研究吸引了最多的注意力。由于 人有着大量的组织、细胞类型和发育阶段，对人 蛋白质组的研究主要聚焦在特异的组织、细胞和 疾病上。已有的证据表明，尽管人的不同组织有 着很大的差别，但其中的许多蛋白质是看家蛋 白，因此它们的双向图谱可能也是近似的。这点 与简单生物不同，因此对于人类来说，一个高质 量的基本的双向图谱是非常有用的，它可以作为 其他组织、细胞的参照图谱。 人的各类组织、器官、细胞乃至各种细胞器已被 广泛研究。人的各种体液(血液、淋巴、脊髓、乳 汁和尿等都被用于研究与某些疾病的关系。澳大 利亚的科学家已经利用双向电泳技术研究眼泪中

16、的蛋白质与生理状态的关系，并发现一种新的蛋 白质与在乳腺癌细胞里高表达的另一种蛋白质非 常相似，这一发现可能会提供疾病诊治的新手 段。在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对 人体毒性的研究中发现，乙醇会改变血清蛋 白糖基化作用，导致许多糖蛋白的糖基缺乏，如 转铁蛋白。 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 研 仪 器 学 科 蛋白质组学 肿瘤至今仍是人类的一个顽敌，癌细胞不仅有许 多特异蛋白质产物，而且这些产物还会影响其他 蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平。 肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以往其他技术所 不能提供的早期诊断依据，如利用不同细胞组织 的特征蛋白质谱，可以判别一些难以判定来源的 肿

17、瘤细胞的来源。丹麦的一个研究组利用蛋白质 组研究技术结合组织冰冻切片技术分析了150例膀 胱癌病人的组织，发现在所有的鳞状细胞瘤的尿 液中均能发现一种化学引诱剂银屑素 (psoriasin，推测其极可能作为这种肿瘤的早期标 志物。 一些科学家致力于各种肿瘤组织与正常组织之间 蛋白质谱差异的研究，这些组织包括脑、胸腺、 乳腺、肺、直肠、肾、膀胱、卵巢、骨髓等，这 些研究已经找到了一些肿瘤特异的标志物，可能 会对揭示肿瘤发生的机制有所帮助。例如，在对 肾癌的研究中发现有4种蛋白质存在于正常肾组织 而在肾癌细胞中缺失，其中两种分别是辅酶Q蛋 白色素还原酶和线粒体泛醌氧化还原复合物I， 这揭示线粒体功

18、能低下可能在肿瘤发生过程中起 重要作用。 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 4植物的蛋白质组学研究 仪 器 植物蛋白质组学研究已经在许多物种中开展。已对植物发育的不同阶 段、不同器官及组织、不同细胞器及膜系统的蛋白质组变化有了较多 工作，环境因子刺激下蛋白质组的变化、不同基因型的蛋白质组差异 以及基因进化等方面也有较为系统的蛋白质组学研究。像在医学和微 生物学中一样，蛋白质组学将很快成为植物生物学中破译基因功能和 贡献于育种程序的主要途径。建立作物的蛋白质组数据库对于研究它 们的生长发育机理、防治病虫害及遗传育种都有重要意义。通过蛋白 质组分析也有助于确定作物优良性状基因，从而加快作物遗传育种的

19、 发展。在植物上目前的数据库主要集中在模式植物拟南芥、重要的粮 食作物水稻、玉米以及松树等植物上，这些数据库都提供可以点击的 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳图像，还包括植物各器官(根、茎、叶、 芽、种子、各组织(愈伤组织、木质部、韧皮部或基因型间多肽形式 的比较。 科 蛋白质组学 研 二、蛋白质组学的研究现状及发展趋势 (一蛋白质组研究的现状 学 澳大利亚的Australian Proteme Analysis Facility(APAF，投资700万 美元，并建立新大楼。美国国立卫生研究院(NIH提出的未来15年发 展纲要NIH线路图(NIHRoadmap，投入了大量经费支持蛋白质 组研究； 美国能

20、源部2003年底出炉的美国未来二十年大型科学设施展望明 确把蛋白质组学大型设施作为其发展重点之一，资助经费在5000万美 元以上。欧共体先期资助了酵母蛋白质组研究并取得重要进展，随后 在“第六框架计划” (sixth framework programme中将蛋白质组学研 究列为优先资助的重要领域。 日本启动了“蛋白质3000计划”(protein3000 project，在结构蛋白质 组研究项目上已经投入7亿美元的研究经费。 许多跨国公司，尤其是制药企业和一些分析仪器公司纷纷投入巨资， 加强对蛋白质组的研究，抢占蛋白质组研究相关产业的巨大市场。独 立完成人类基因组测序的Celera公司也宣布

21、投资上亿美元于蛋白质组 学领域。总而言之，这一新兴领域已成为国家、企业等多个层次的国 际性战略争夺目标。 18 科 2001年，国际人类蛋白质组组织(human proteome 蛋白质组学 研 organization，HUPO成立，提出了人类蛋白质组计划 仪 (human proteome project，HPP。人类蛋白质组计划是继 器 人类基因组计划(human genome project，HGP之后生命科 学 学领域最大规模的国际性科技工程，也可能是21世纪第一个 重大国际合作计划。由于蛋白质组研究的复杂性和艰巨性， 人类蛋白质组计划将按人体组织、器官和体液分批启动的策 略实施。首

22、批行动计划包括由美国科学家牵头的人类血浆蛋 白质组计划和由中国科学家牵头的人类肝脏蛋白质组计划。 随后由英国科学家牵头的蛋白质组标准化计划、由德国科学 家牵头的人类脑蛋白质组计划、由瑞典科学家牵头的人类抗 体计划、由日本科学家牵头的糖蛋白质组计划以及由加拿大 科学家牵头的人类疾病的小鼠模型蛋白质组计划相继启动。 最近，HUPO正酝酿启动重要疾病生物标志物计划，致力于 利用蛋白质组学技术寻找重要疾病的生物标志物，以提高其 预警、早期诊断和治疗水平。在HPP的起始阶段，已初步构 建了人血浆、胎肝、成人肝脏蛋白质组表达谱。从2006年开 始，HPP进入全面发展阶段，蛋白质组表达谱的构建已经逐 步由起

23、始阶段数量上的竞争，向标准化、定量化、动态化和 功能化发展，并且更加关注低丰度的蛋白质。同时，蛋白质 组的修饰谱、相互作用网络以及全细胞亚细胞的定位研究 也逐步深入。 研 仪 器 学 科 蛋白质组学 蛋白质组研究的速度是惊人的，新的思路和技术不断涌现。在国际上 激烈的蛋白质组研究竞争中，我国面临的挑战是十分艰巨的。不过， 我国对此十分重视，并且在蛋白质科学领域方面也取得过包括胰岛素 人工合成等国际水平的成果，有很好的基础。在1998年，国家自然科 学基金委员会就设立了重大项目“蛋白质组学技术体系的建立”。同 年，在中科院上海生化所举办了全国性的蛋白质组学术研讨会，推动 了我国的蛋白质组学研究。

24、在中国科学院生物化学研究所、军事医学 科学院、复旦大学与湖南师范大学初步建立了以生物质谱为代表的技 术平台，启动了蛋白质组学研究，并在国际上较早提出了功能蛋白质 组学的研究策略。“十五”期间，国家“973'项目“人类重大疾病的蛋白 质组学研究”、国家科技攻关项目“人类重大疾病与重要生理功能相关 的蛋白质组学研究”、国家“863'项目“蛋白质组研究技术平台的建立 及其在癌症研究中的应用”和“蛋白质组技术平台的建立及其在肿瘤泛 素通路研究中的应用”以及北京市重大科技项目“肝脏及重大肝病的蛋 白质组学研究”等项目相继启动。这些项目针对严重影响我国人民健 康的重大疾病和重要生命科学问题

25、开展了系统的蛋白质组研究。 科 研 仪 器 学 蛋白质组学 研 仪 器 中国科学家团队于2002年在国际上率先提出了“人类肝脏蛋白质组计 划” (Human Liver ProteomeProject，HLPP，对人类疾病(如肝病特 别是肝炎和肝癌疾病的研究给予了高度的关注，这些研究从一个侧 面揭示了疾病发生和发展的机制以及疾病防、诊、治的分子标记物和 药物靶标，并提出了蛋白质组“两谱(表达谱、修饰谱、两图(连锁图 和定位图、三库(样本库、抗体库和数据库”的科学目标，获得国际 学术同行的认同与响应。这是第二个人体组织器官的蛋白质组研究 计划。HLPP一经提出就引起全球蛋白质组学领域科学家的高度关 注，目前报名参与该研究项目的国家有中国、美国、法国、加拿大等 18个国家和地区的100多家实验室。Nature、Science和Nature Biotechnology等杂志相继高度评价了此项计划。2004年，国家科技部 启动了“中国人类肝脏蛋白质组计划”重大专项，国内70余家实验室共 同参与了该计划。在我国中长期科技发展规划中，蛋白质组研究作为 “蛋白质研究计划”