土壤酶实验步骤

1、土壤酶的测定1 三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。2 土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g ，重复一次，14.5×2=29g。一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）1试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：（1：100 30%的H2O2和水）（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）(3)0.1N高锰酸钾溶液 ：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）2操作步骤：2g风干土置100三角烧瓶注入40ml蒸馏水和5

2、ml 0.3%过氧化氢（现配）在往复式振荡机上振荡20min加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）用慢速型滤纸过滤，吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色3结果计算过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示： M=（AB）×T式中：A：空白消耗的0.1N KMnO4 毫升数B：滤液消耗的0.1 N KMnO4 毫升数T：KMnO4滴定度的校正值备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰

3、酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2 KMnO45H2O23H2SO42MnSO4K2SO48H2O5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（P278）滴定法1.试剂配制：(1)20蔗糖：（20g蔗糖80ml水或12.5g蔗糖50ml水）(2)甲苯(分析纯)(3)PH5.5醋酸盐磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠·12 H2O(1/15M) + 9.5ml 磷酸二氢钾（1/15M）磷酸氢二钠·12H2O(1/15M) ：23.88g Na2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。 磷酸二氢钾（1/15M）：9.072g KH2

4、PO4，加H2O溶解，定容至1000ml。(4)33%KI溶液（4.925g+10ml水）现配，冰箱遮光(5) H2SO4（1：3）（体积比）：15ml 98%H2SO4 + 45ml蒸馏水(6)淀粉指示剂取0.5g淀粉溶于少许水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。（2.5%NaCl：2.5g NaCl加97.5ml蒸馏水。）(7)0.1NNaS2O3 滴定液取25克-溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1升。(8)菲林溶液取3.464克CuSO4· 5H2O溶于蒸馏水，并稀释至50ml（a）,取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于蒸馏水，并稀释至

5、50ml（b），使用前将（a）（b）按1：1混合。2.操作步骤取2.5g土置于100ml三角瓶用0.375ml甲苯处理15min。加2.5ml 20蔗糖和培养结束后，加12.5ml蒸馏水。摇荡后过滤，取5ml的滤液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液，在沸水浴上放置10min，冷却至室温后，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4（1：3）。加入淀粉指示剂2滴，然后用0.1NNaS2O3 滴定。颜色：棕色棕蓝色乳白色（滴定结束）注意：减量滴定，一般取5ml即可，滴定需NaS2O3溶液（大量）空白对照：30.15ml（取5ml时）3 结果计算：蔗糖酶活性（M），用对照与试验

6、的0.1NNaS2O3滴定量毫升数之差表示。试验应设以水20毫升代替基质。M=（AB）×T×17.875/5/2.5式中：A：对照所消耗的0.1NNaS2O3 毫升数B：滤液所消耗的0.1NNaS2O3毫升数T：NaS2O3 滴定度的校正值×17.875/5/2.5：换算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3 量三、脲酶1.试剂配制(1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中，另取2.95g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将PH调至6.7，并将水稀释至20ml 。(2)苯酚钠溶液称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和

7、18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中。称27gNaOH溶于100ml水中（B液），存于冰箱中。使用前，取A,B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。(3)次氯酸钠溶液用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（17.3mlNaClO定容至100ml）。(4)10%尿素液10g尿素90ml水50g尿素450ml水(5)甲苯(6)氮的标准溶液（不要配）精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。绘制氮的标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。2.操作步骤取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15

8、min加10ml 10%尿素液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。摇匀后在37恒温箱中培养24h。过滤后取3ml滤液注入50ml锥形瓶中，然后加蒸馏水20ml，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20min后显色，定容50ml：1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。然后按绘制标准曲线（显色方法）进行比色测定。3结果计算：脲酶活性（M）以24h后1g土壤中NH3N的毫克数表示M=x×31/3/5标准曲线：y=0.0268x+0.001804即：M=（0.001804-y）×31/3/5/0.0268式中：x：从标准曲线查得的NH3N毫克数y：578nm处

9、吸光度×31/3/5：换算成1g土的系数四、磷酸酶1.试剂配制(1)PH=9.8氯化铵氢氧化钠缓冲液取20g NaOH溶于100mlNH4OH中(2)8%铁氰化钾液称8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中稀释至100ml（仅在同一周内存放）(3) 2% 4氨基安替比林液取1g 4氨基安替比林溶于水中，稀释至50ml（仅在同一周内存放）(4)0.5%磷酸苯二钠溶液取1g溶于200ml水中(5) 酚的标准溶液（不要配）酚原溶液的配制及酚工作液的稀释浓度同磷酸苯二钠法酚原液：取1g重蒸酚溶于水中，稀释至1L存于棕色瓶中酚工作液：取10ml酚原液稀释至1L（0.01mg/ml酚）(6) 甲苯标准曲线绘制

10、吸取1,3,5,7,9,11,13ml酚工作液，分置50ml的容量瓶中，分别加20ml蒸馏水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml4氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。根据光密度值于溶液浓度绘制标准曲线。50（2020.50.50.25）=26.75ml蒸馏水2.操作步骤取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加5滴甲苯。20ml 0.5%磷酸苯二钠，充分振荡后在37恒温箱中培养2h。取培养后滤液5ml，分置50ml的锥形瓶中，加20ml蒸馏水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml 4氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。3计算磷酸酶的活性（M），以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示Mx×80×0.32×2.29标准曲线：y=0.002161