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文档简介
1、楼上说的准确的叫。就是免疫沉淀,没有“共” ,哈哈。 其实楼主的 意思是既然有 2 2 的抗体,直接检测 ,就可以了, 为什么还要用以后 的样品来检测,这是因为 2 商业化的抗体特异性不好, 可能对或其他 类似的磷酸化蛋白有交叉, 所以我们一般为了准确性, 看其磷酸化的 变化,就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来,在用 4G10 抗体来检测。而且这个方法看的是 2 蛋白全部的磷酸化位点的情况,而 2 商业化 抗体一般都是识别某一格磷酸化位点的, 所以这两种试验是有本质区 别的,这种方法还应用于很多 磷酸化的检测, 因为这些蛋白磷酸化 位点都特别多哈: )免疫沉淀是指用抗体把抗原(包括单体、复合物)沉
2、淀下来 ,是一 种抗原纯化、浓集的方法;免疫共沉淀 指用抗体把抗原复合物沉淀 下来,常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀( , )免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。 抗体 与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白()或二抗 偶联的或珠子孵育,通过离心得到珠子 -蛋白或二抗 -抗体 -目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸 5-10 ,在 高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包 括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。基本实验步骤1 )收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂) ,冰上 或者4 C裂解30, 12,000g
3、离心30后取上清;(2)取少量裂解液以备 分析,剩余裂解液将1 gg相应的抗体和 10-50 gI 加入到细胞裂解液, 4°C 缓慢摇晃孵育过夜;3)免疫沉淀反应后,在 4°C 以 3,000 g 速度离心 5 ,将 离心至 管底;将上清小心吸去, 用 1 裂解缓冲液洗 3-4 次;最后加入 15gI的2 X加样缓冲液,沸水煮10分钟;4 ), 或进行质谱分析。样品处理:免疫沉淀实验成功与否, 第一步处理样品非常关键。 免疫沉淀实验本 质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应, 而样品处理的质 量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量, 浓度以及抗原是否处于天然 构象状态。所
4、以制备高质量的样品以用于后续的抗体 孵育对免疫沉 淀实验是否成功非常关键。 在这个环节中, 除了要控制所有操作尽量 在冰上或者 4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂 解液。我们以常用的裂解液为例(主要含有 7.4 左右的离子缓冲液, 接近生理浓度下的 ,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途, 进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a. 缓冲液:离子缓冲液常采用 7.4 的或者。b. 浓度一般习惯用 150 , 这主要是因为 150 接近生理浓度,不会破坏蛋白
5、质之间的相互作用。然而细胞内部的浓度并不是均一的, 局部的浓度可以低到 50 ,150 的有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作 用。因此裂解液配方最佳的浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的 保护作用。一般添加 10% 的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器 的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。 而由于用于免疫沉淀实验 的去垢剂作用比较温和, 因此蛋白酶的活性大部分得以保存。 还有一 部分蛋白酶来自胞质中, 主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受 到改变后从而恢复了蛋白酶
6、活性。 因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止 目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。 一般主要通过添加 抑制金属蛋白酶,通过 (多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白 酶。e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键 的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三 个因素来影响免疫沉淀效果:- 细胞质/ 器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所 以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验, 需要谨慎地尝试多种去垢剂以及 不同浓度。- 蛋白相互作用: 不同去垢剂
7、对不同性质的蛋白质的相互作用影响程 度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测, 所以一 个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和 浓度。抗体 孵育裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在 -80 °保 存 3 个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体 孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入 A 或 者 G 孵育过夜,也可以同时加入抗体和 A 或者 G 孵育过夜。一般 选择 1 总蛋白( 1 )对应添加 1 抗体,最高可以添加至 5 抗体,过 多的抗体会
8、产生假阳性。 这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对 照。一般选用加同样量的 ,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白 A 的免疫沉淀,选择膜 蛋白 B 来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质 可溶性蛋白 C 的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白 D 来做阴性 对照。同时,为避免 A或者G有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将 A 或 者 G 与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体 孵育。同时, A 或者 G 对不同类型的抗体亲和力不同, 结合一抗的种属和 亚型,选择合适的 A 或者 G
9、 也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个 重要因素。一般推荐使用 A 和 G 的混合物,这样可以达到最佳实 验效果,而且省去了许多选择的烦恼。抗体 复合物洗涤:除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外, 去除免疫沉淀 实验非特异性的一个办法是对抗体 复合物进行多次洗涤。一般洗涤 缓冲液使用和裂解液一样的配方, 但去除甘油, 以减少由于甘油的粘 性带来的非特异性吸附。 针对不同的实验要求, 还可以通过更改的浓 度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如, 针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉 淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度0.2-0
10、.5% )的洗涤抗体 复合物, 这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛(见 : ),而且基于最基本的免疫沉淀实 验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段 (比如免疫共沉淀, 染色质免 疫沉淀和蛋白免疫沉淀) ,因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实 验目的而定。我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加 与样品孵育, 因此在最后离心获得抗体 复合物后,管中主要含有抗体, 目的蛋白, 以及一些其它非特异性作用蛋白。 其中,抗体和目的蛋白以及 三者 之间是以非共价健结合在一起, 只有 与 是共价结合在一起的。 因
11、此, 最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去 后,管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。 这样中就含 有目的蛋白和抗体二种蛋白, 由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导 致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重 链分子( 55 )和轻链分子( 25 )。因此,显色反应中除了能检测到目 的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同 一种属的话, 还能检测到重链和轻链分子。 通常用于免疫沉淀的抗体 量非常大 (1),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时, 重 链或者轻链分子的信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的 结果判断。针对上述
12、情况,通常有二种解决办法:a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和实验,这样再选择 一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行实验, 就可 以大大减弱重链和轻链分子的信号。b. 使用交联剂将抗体和 交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样 缓冲液处理目的蛋白 - 抗体 复合物,最后离心去除抗体 复合物,上 清中只留下目的蛋白。免疫共沉淀( , )是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的A或G特异性地结合到免疫球蛋白的片段的现象开发出来的方法。 其基本原理是, 在细胞裂 解液中加入抗兴趣蛋白的抗体, 孵育后再加入与抗体特异结合的结合 于珠上的A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就
13、可以形成这样一种复合物: “目的蛋白兴趣蛋白抗兴趣蛋白抗体A或 G ”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫 印迹或质谱检测目的蛋白。 这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴 趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种 方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合; 也可用于确定一种 特定蛋白质的新的作用搭档。免疫共沉淀优点1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态; 2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物免疫共沉淀缺点1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用;2)两种蛋白质的
14、结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;3 )必须在实验前预测目的蛋白是什么, 以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。原理:免疫共沉淀()是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件 下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被 保留了下来。如果用蛋白质 X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的 A预先结合固化在的上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,上的 A 就能吸附抗原
15、达到精制的目的。 这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结 合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的, 可以避免人 为的影响;(3 )可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 缺点 为:(1 )可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用;2 )两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间 起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后 检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具 有冒险性。二、准备工作:预冷, ,细胞刮子(用保鲜
16、膜包好后,埋冰下) ,离心机1. 用预冷的洗涤细胞两次,最后一次吸干;2. 加入预冷的 (1107 个细胞、 10 培养皿或 1502 培养瓶, 0.55X 106个细胞、6培养皿、752培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下, 把悬液转到1.5管中,4 C,缓慢晃动15 (管插冰上,置水平摇床上)4. 4 C, 14000g离心15 ,立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备 A ,用 洗两遍珠子,然后用配制成 50% 浓度,建议减掉 枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6.每1总蛋白中加入100 kJ A琼脂糖珠(50% ),4 C摇晃10 (管 插冰上,
17、置水平摇床上) ,以去除非特异性杂蛋白,降低背景7. 4 C, 14000g 离心 15 ,将上清转移到一个新的离心管中,去除A 珠子8. ( 法 )做蛋白标准曲线, 测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释 1 :10 倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可 以在-20 C保存一个月)9.用将总蛋白稀释到约1 k h以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10卩k)10.加入一定体积的兔抗到500 kl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4 C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用
18、 2 h 室温孵育12.加入100 kl A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4 C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议 加2 kJ"过渡抗体"(兔抗鼠,兔抗鸡)13. 14000 瞬时离心 5s ,收集琼脂糖珠 -抗原抗体复合物,去上清,用预冷的 洗3遍,800卩遍,有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合 物内部的结合,可以使用14.用60 M 2 X上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60讪足够上三道)15. 将上样样品煮 5 ,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电 泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也
19、可以暂时冻-20 C,留待以后电泳,电泳前应再次煮 5 变性。配制:基础成分:缓冲液成分,防止蛋白变性)盐份,防止非特异蛋白聚集)40 (非离子去污剂,提取蛋白;用 H2O 配制成 10% 储存液)去氧胆酸钠(离子去污剂, 提取蛋白;用 H2O 配制成 10% 储存液; 避光保存)注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子 型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟()(用异丙醇配制成 200 的储存液,室温保存)钙螯合剂;用 H2O 配制成 100 的储存液, 7.4)亮抑酶肽()(用H2O配制成1的储存液,分装,-20 C保存)抑蛋白酶肽()(用H2O配制
20、成1的储存液,分装,-20 C保存)胃蛋白酶抑制剂()(用甲醇配制成1的储存液,分装,-20 C保存)磷酸(酯)酶抑制剂激活的 34(用 H2O 配制成 200 的储存液,见 )200 的储存液,室温保存)注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制:配制 100 的直到1. 称取 790 的,加到 75 去离子水中,加入 900 的,搅拌, 全部溶解,用调节值到 7.42. 加 1010% 的 403. 加 2.510% 的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清4.加1100的,用量筒定容到100 , 2-8 C保存5. 理论上, 蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入
21、蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100山,34,各500但是在水溶液中很不稳定, 30 分钟就会降解一半,所以应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5 天。各种成分在工作液中的终浓度:* : 50 ,7.4 * 40: 1% * 去氧胆酸钠: 0.25%* : 150* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽 , 胃蛋白酶抑制剂 : 各 1 d * 34: 1三、实验流程为:1) 转染后 24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液含蛋白酶抑制剂),冰上裂解 30, 细胞裂解液于 4 °C, 最大转速 离心 30 后取上清;(2) 取少量裂解液以备 分析,剩余裂解液加1相应的抗体
22、加入到细胞裂解液, 4°C 缓慢摇晃孵育过夜;(3) 取10 M A琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3次,每次3,000 离心 3 ;(4) 将预处理过的10 d A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C 缓慢摇晃孵育 2-4h ,使抗体与 A 琼脂糖珠偶 连;5)免疫沉淀反应后,在 4°C 以 3,000 速度离心 3 ,将琼脂糖珠离心至管底; 将上清小心吸去, 琼脂糖珠用 1 裂解缓冲液洗3 4次;最后加入15 d的2 X上样缓冲液,沸水煮5分钟;6 ), 或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白1 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 培养板上的适宜细胞
23、。刮去每块板 上的细胞到 1 冰冷的裂解缓冲液中。2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中, 在微量离心机上4 C以最大速度离心15 。3收集上清(约30 )并加入30的适当抗体,4 C摇动免疫沉淀物 1 h 。4加入 0.9的蛋白质 悬液,4 C摇动免疫沉淀物30。5 用含 900的洗蛋白混合物, 再重复洗 5 次。最后,用洗一次。6 .吸出混合物的液体部分。加入 800 M的1 X胶加样缓冲液到球珠中,煮沸 4 。7将样品加入到大孔的不连续梯度胶中, 在 10 的恒定电流下电泳 过夜。8通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。9 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用 1 50% 乙腈洗10 用
24、胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。 将收集的肽在 477A 或 494A机器上进行自动降解测序。四、注意的问题:1 )细胞裂解采用温和的裂解条件, 不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂( 40 或 100) 。每种细胞的裂解条件是不一样的, 通过经验确定。 不能用高浓度的变 性剂( 0.2 ),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的2) 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用3) 使用对照抗体:单克隆抗体:正常小鼠的或另一类单抗 兔多克隆抗体:正常兔 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:八、(1) 确保
25、共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。染色质免疫共沉淀技术()真核生物的基因组以染色质的形式存在。 因此,研究蛋白质与在 染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术( , )是目前唯一研究体内与蛋白质相互作用 的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质复合物, 并将 其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,
26、然后通过免疫学方法 沉淀此复合体, 特异性地富集目的蛋白结合的片段, 通过对目的片断 的纯化与检测, 从而获得蛋白质与相互作用的信息。 不仅可以检测体 内反式因子与的动态作用, 还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与 基因表达的关系。而且,与其他方法的结合,扩大了其应用范围:与基因芯片相结合建立的方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通 量筛选;与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点; 用于研究在基因表达调控中的作用。由此可见,随着的进一步完善, 它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。染色体免疫共沉淀( ,)是基于体内分析发展起来的方法,也称 结合位点分析法, 在过去十年已
27、经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现 何种组蛋白修饰。 不仅可以检测体内反式因子与的动态作用, 还可以 用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 近年来,这种技 术得到不断的发展和完善。 采用结合微阵列技术在染色体基因表达调 控区域检查染色体活性, 是深入分析癌症、 心血管疾病以及中央神经 系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。染色质免疫共沉淀原理它的原理是在保持组蛋白和联合的同时, 通过运用对应于一个特A ”特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的
28、“ 异性地结合到免疫球蛋白的片段的现象活用开发出来的方法。 目前多 用精制的 A 预先结合固化在的上,使之与含有抗原的溶液及抗体反 应后,上的 A 就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就 是抗体的性质。 抗体不同和抗原结合能力也不同, 免染能结合未必能 用在反应。建议仔细检查抗体的说明书。 特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。 多数的抗原是细胞构成的蛋 白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有 强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即 便溶解也产生与其它的蛋白结
29、合的结果, 抗原决定族被封闭, 影响与 抗体的结合,即使成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次, 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂, 低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体 / 缓冲液的比例。抗 体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在上,残存在上清。缓冲 剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。的一般流程的一般流程:甲醛处理细胞收集细胞, 超声破碎加入目的蛋白的抗体, 与靶蛋 白复合物相互结合加入,结合抗体 - 靶蛋白复合物,并沉淀对沉淀下 来的复合物进行清洗, 除去一些非特异性结合洗脱, 得到富集的靶蛋 白复合物解交联,纯化富集的片断分析。在分析这一块
30、,比较传统的做法是半定量。但是现在随着荧光定 量的普及,大家也越来越倾向于了。 此外还有一些由衍生出来的方法。例如(其实就是用的方法研究细胞内蛋白与的相互结合, 具体方法和 差不多,只是实验过程中要注意防止, 最后分析的时候需要先将逆转录成为);还有(其实就是富集得到的片段,拿去做芯片分析,做法在的基础上有所改变, 不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。具体操作流程:第一天:一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出 1 平皿细胞( 10 平皿),加入 243醛的终浓度为 1% (培养基共有 9)。2、37 摄氏度孵育 10 。3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。 45
31、02.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5 即可。4、吸尽培养基,用冰冷的清洗细胞2 次。5 、细胞刮刀收集细胞于 15 离心管中(依次为 5 ,3 和 3 )。预 冷后 2000 5 收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量,加入 。使得细胞终浓度为每 200含2 X 106个细胞。这样每100溶液含1 X 106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设7长满板为5 X 106个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4X106 个细胞。因此每管加入 400 。将2管混 在一起,共 800 。7、超声破碎:750, 25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。二)、除杂及抗体哺育。8、超声破
32、碎结束后, 10, 000g 4 离心 10 。去除不溶物质。留取 300 做实验,其余保存于 -80 。300 中, 100 加抗体做为实验组; 100 不加抗体做为对照组;100 加入 45 (终浓度为 0.2M ),65 处理 3h 解交联,跑电泳,检测 超声破碎的效果。9、在100的超声破碎产物中,加入 900和20的50 X。再各加入 60 。 4 颠转混匀 1h 。10、 1h 后,在 4静置 10 沉淀, 700 离心 1。11 、取上清。各留取 20 做为。一管中加入1 抗体,另一管中则不加抗体。 4 颠转过夜。三)、检验超声破碎的效果。取 100 超声破碎后产物,加入 45电泳检测超声效果。, 65 处理 2h 解交联。分出一半用酚 / 氯仿抽提。第二天:一)、免疫复合物的沉淀及清洗。12 、孵育过夜后,每管中加入 60。 4 颠转2h。13、 4静置 10 后, 700 离心 1 。除去上清。1 4 、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。 清洗的步骤: 加入溶液, 在 4 颠转 10 , 4 静置 10 沉淀, 700 离心 1 ,除去上清。洗涤溶液
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