薯蓣皂苷增强大鼠缺血再灌注损伤后心肌抗氧化能力

1、44中药药理与临床2009;25(5)wasmarkedlyimprovedthetherapeuticeffectofsesamin+vitaminE(30+20mg/kg)surpassedtheoneofonlyusingsesaminandvitaminE,respectively(P<0.01orP<0.05).Conclusion:SesaminandVitaminEhavesynergisticantioxidantactivityandprotectiveeffectonmy2ocardiumofmetabolicsyndromerats.Keywordssesam

2、in;vitaminE;metabolicsyndrome;myocardium;synergisticeffects薯蓣皂苷增强大鼠缺血再灌注损伤后心肌抗氧化能力汪玲芳,赵云茜,高卫真,娄建石,康毅(天津医科大学药理教研室,天津300070)333目的:研究薯蓣皂苷药理性预适应对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用,并从氧化2抗氧化角度初步探讨其作用摘要机制。方法:大鼠被随机分为缺血/再灌注(I/R)、心脏缺血预适应(CIP)、薯蓣皂苷高剂量(DH)、薯蓣皂苷低剂量(DL)4组。I/R、CIP组0.9%生理盐水10ml/kg灌胃,DH、DL组薯蓣皂苷279mg/kg、139.5mg/kg灌胃,

3、连续7d。末次给药24h后,各组动物均经历心肌缺血/再灌注损伤,CIP组于缺血前行心肌缺血预适应。连续监测血压和心电图变化,检测心肌梗死范围,测定血浆中肌酸激酶(CK)活性及NO含量,检测心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量,RT2PCRMn2SOD表达。结果:与I/R组相比,CIP、DH及DL组ST2段抬高幅度降低,NO、SOD活性升高,Mn2SOD表达增强,CK活力下降,MDA含量减少。结论:,其机制与增强心肌抗氧化能力有关。关键词薯蓣皂苷;缺血预适应;含薯蓣皂苷(di13。,具有活血化瘀、行气止痛、宣痹通阳、补益气血等功能,已广泛应用在抗心血管病药物之中,具有减慢

4、心率、降低血压、增加冠脉流量、改善心脏舒缩功能及保护缺血损伤心肌等作用,并且在一定程度上能够保持心肌细胞膜结构的完整性,对心功能具有明显的保护作用。本研究在前期研究4的基础上,比较心肌缺血预适应(CIP)及薯蓣皂苷的心肌保护作用,并从氧化2抗氧化角度探讨薯蓣皂苷的作用机制。1.5方法将大鼠随机分为4组:I/R组,CIP组,薯蓣皂苷高(DH)、低剂量组(DL)。I/R及CIP组给予10ml/kg生理盐1材料与方法1.1试验药物薯蓣皂苷原料药,纯度93%,棕色粉状,易溶水,DH和DL组分别给予279、139.5mg/kgd薯蓣皂苷,连续7d,末次灌胃24h后,实施手术。5于水,由国家天然药物工程技

5、术中心提供。1.2动物Wistar大鼠,雄性,体重250300g,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。1.3试剂2,3,52氯化三苯基四氮唑(TIC),Sigma公司;CK、NO、SOD、MDA测试盒均购自南京建成生物工程研究所;Trizol购自Invitrogen;RT2PCR试剂盒,Marker,Mn2SOD及内参2actin引物均购自宝生物工程(大连)有限公司。1.4仪器BL2420E生物机能实验系统、HX2200型动物人工呼吸机(成都泰盟科技有限公司);UNIVERSAL216R高速冷冻离心机(HettichEntrifvgen,德国);RT2PCR仪(Mastercycl

6、ergradientAuthorizedThermalCycler,德国);DYY212C型电泳仪(北京市六一仪器厂);UNIVERSALHOOD凝胶成像系统(BIO2RADLaboratories,意大利)。前执行IPC程序,即大鼠心脏经历5min缺血,继之5min再灌注,重复3次。注射0.6%台盼蓝2ml。迅速取下心脏,于生理盐水中洗净残血和染料,220冰箱冷冻20min。由心尖部向心基底部方向将心脏切成1mm厚的切片,分离出不着色的危险区(areaatrisk,AAR)心肌组织,置于1%TIC溶液中,37孵育20min。濒死区心肌组织被染为砖红色,梗死区(infarctsize,IS)心

7、肌为灰白色。用10%福尔马林溶液固定标本,将Is从AAR中分离出来,电子天平精确称重,并计算IS与AAR重量比值(IS/AAR%)。3基金项目:国家天然药物工程技术中心资助课题(NO200703)33通讯作者中药药理与临床2009;25(5)45血30min、再灌120min时从股静脉取血0.4ml,立即放入低温高速离心机中,620g,离心15min,收集血浆,置270冻存。按试剂盒说明书检测CK、NO活性。于再灌注2h取左室前壁心肌组织,置于270冰箱冻存,1月内以生理盐水为介质制备10%组织匀浆,按试剂盒说明书操作,检测SOD活性以及MDA含量。保存。RT2PCR使用试剂盒检测。RT反应条

8、件:4725min,995min,55min,1Cycle。PCR反应:预变性945min;9445s、6445s、721min,31个循环;终末延伸7210min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,应用凝胶影像分析系2actinmR2统进行电泳图像的采集,应用同一系统对Mn2SOD、表1各实验组不同时间ST2段数值(x󰁡±s,n=8)分组I/RCIPDHDL279139.5NA的RT2PCR产物的光密度和面积进行定量分析,计算Mn22actin的光密度积分比值,确定心肌组织中Mn2SODmR2SOD/NA的相对表达量。2结果2.1血压和心率缺血后,4组的平均动脉压和

9、心率均呈降低趋势,再灌注后有所回升,但均低于缺血前水平,各组间差异无显著性。2.2心电图ST2段缺血期4组的ST2段均呈进行性抬高,至缺血30min达峰值,但CIP,DH及DL组ST2段抬高幅度均低于I/R组(P<0.01),组间差异无显著性。再灌注后各组ST2段均逐步恢复至缺血前水平,各实验组之间的ST2段高度差异均无统计学意义,见表1。剂量(mg/kg)结扎前缺血立即30min3333#与结扎前比较3P<0.3301;与#P<012.3心肌梗死面积,与I/R组相比,CIP,DH及DL组梗死范围明显减少,IS/AAR比值明显降低,三组之间无显著差异,见表2。表2各实验组心肌

10、坏死情况(x󰁡±s,n=8)分组I/RCIPDHDL279139.5剂量()7133与IR组比较3P<0.05,33P<0.01(下同)图1Mn2SOD的表达:A:DH;B:DL;C:CIP;D:I/R2.4心肌氧化、抗氧化物质检测与I/R组相比,CIP,DH及DL组再灌注末血浆CK活力明显降低,NO含量明显升高;心肌组织中抗氧化酶SOD活性明显升高,脂质过氧化产物MDA含量则明显减少,见表3。表3各实验组心肌氧化抗氧化物质水平(x󰁡±s,n=8)组别I/RCIPDHDL2793讨论薯蓣皂苷广泛存在于薯蓣科、百合科和豆科等植物中,

11、其中剂量()50339633122.55±18.11983073344.70±11.2633313369331.44±0.303333在薯蓣科植物中的含量丰富。它对于冠心病、动脉粥样硬化、高血脂等心血管疾病有很好的治疗作用。但其作用机制并不十分清楚。本研究采用I/R模型观察薯蓣皂苷对心肌的保护作用,从氧化抗氧化角度探讨其机制。心律失常是心肌I/R损伤的重要特征,而心肌梗死范围被认为是判断心肌I/R损伤严重程度的"金标准"。本研究以早期CIP作为阳性对照,结果表明薯蓣皂苷可降低缺血期心律失常发生,缩小心肌梗死范围,具有与CIP程度相当的心脏保护作

12、用。139.53333332.5心肌组织Mn2SOD表达I/R组在缺血区内Mn2SOD的基因表达明显下调,与I/R组相比,CIP,DH,DL组则下调幅度变小,而内参照2actin的表达无明显变化,见表4,图1。表4各组心肌Mn2SOD表达情况(RT2PCR)(x󰁡±s,n=8)分组I/RCIPDHDL279139.5剂量(mg/kg)缺血区0.45±0.12心肌I/R损伤的发生机制涉及氧自由基(oxygenfreeradi2cal,OFR)损伤、钙超载、中性粒细胞浸润、能量代谢障碍6等。其中,OFR是I/R损伤的直接原因。正常情况下,机体存在SOD、GSH2

13、PX、过氧化氢酶等内源性抗氧化防御系统,可及时清除OFR。但缺血缺氧情况下,OFR清除系统功能减弱或丧失,而生成系统潜在活性加大,一旦恢复供血供氧,呼吸爆发导致3346中药药理与临床2009;25(5)参考文献1高卫真,王玮,范晓静,等.薯蓣皂苷对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧OFR大量生成,超过抗氧化防御系统的清除能力,必然引起细胞结构和功能的损伤。本研究I/R组再灌注末血浆CK活力升高,脂质过氧化产物MDA含量增加,抗氧化防御系统成员SOD、NO活性降低,均提示I/R组存在明显的过氧化损伤。本实验结果表明,薯蓣皂苷能显著降低CK活性,减少MDA含量,升高SOD活性,特别使心肌细胞线粒体内Mn2

14、SOD表达增强,从而具有抗氧自由基,保护缺血引起的心肌组织损伤作用。哺乳动物体内的超氧化物歧化酶有Mn2SOD和Cu2+,Zn2+22+SOD两种。心肌细胞内Mn2SOD主要位于线粒体,而Cu,2+Zn2SOD则主要位于胞质内。Mn2SOD能够特异性地清除体内的超氧自由基,在SODs家族中扮演着重要的角色。有研究表明,心脏缺血/再灌注损伤的保护与Mn2SOD活性及表达增强有密切关系7,8。本研究的结果也显示,心脏缺血预适应组和薯蓣皂苷高、低剂量组线粒体Mn2SOD活性及表达都较I/R组增强,说明心肌缺血后引起的自由基水平升高,由于氧化应激线粒体抗氧化酶活性增加,表达增强,从而起到保护作用。NO

15、是血管内皮细胞释放的具有舒张血管平滑肌作用的内源性物质,其生成减少与心肌I/R损伤密切相关9。本实验结果表明,薯蓣皂苷能显著升高NO水平,提示本品可改善心肌缺血时血管内皮细胞的功能。有研究表明,害有保护作用10,节作用2,11,。薯蓣皂苷是。损伤的保护作用.中国分子心脏病学杂志,2008;8(2)72742宁可永,李贻奎,高会丽,等.薯蓣皂苷元对大鼠急性心肌缺血的治疗作用.中药新药与临床药理,2008;19(1)133倪岚,许澎,伍旭升,等.薯蓣皂苷对缺氧/复氧心肌细胞损伤的抗氧化作用研究.上海中医药杂志,2007;41(11)76774赵云茜,康毅,高卫真,等.薯蓣皂甙对大鼠心肌缺血再灌注损

16、伤的保护作用.中国心血管杂志,2008;13(6)4344377朱永波,殷桂林,张殿堂,等.腺苷A1受体激动剂诱导心脏缺血预处理延迟效应的实验研究.中国胸心血管外科临床杂志,2004;11(4)2802828解丽君,张建新,李兰芳.异丙酚对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用.中国药理学通报,2007;23()6356419YangXJoxideisapreconditiondingmiravailableinfarct2sparing239,马海燕,等.维奥欣对阿霉素所致大鼠线粒体毒性的保护作用.中华心血管杂志,1998;26(5)33511刘遂心,孙明,李彤.薯蓣皂苷对缺氧心肌细胞肌钙蛋

17、白和细胞内游离钙离子浓度的影响.中国医师杂志,2005;7(11)14951499Dioscinincreasedantioxidativeabilityofmyocardiumafterischemia2reperfusioninjuryinratWangLingfang,ZhaoYunqian,GaoWeizhen,LouJianshi,KangYi(DeptofPharmacology,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070)Objective:Toinvestigatetheeffectsofdioscinonmyocardiumafterischemia2reperfusioninjuryinrats,andtoexploretheroleofmyo2cardialoxidation2antioxidationsystem.Method