论文正文百脉根

1、1 前言土壤盐碱化是人类面临的一个世界性问题，开发和有效利用盐渍化和具有重要的现实意义。提高植物的耐盐是开发和利用大量盐渍化土地最有效的方法之一，也是未来农业发展的重大课题之一。采用传统的方法选育耐盐的植物品种固然简便可行，但进展缓慢，局限性大。随着分子生物学技术的发展，一大批与植物耐盐有关的基因相继得到克隆，植物转基因技术有了重大突破，这为有效利用盐碱地提高作物产量，治理盐渍化土地提供了新的思路和方法。百脉根(Lotus corniculatus L)是豆科百脉根属多年生牧草，又名牛角花、五叶草，蝶形花科多年生草本植物，产于欧亚温暖地区，目前在世界各地广泛种植，我国华东、华中、西南及西北均有

2、分布1。该牧草营养丰富，耐寒、抗旱、耐涝、虫害少，花量大、自交结实、种子结实率高，较易得到稳定遗传的后代；其细胞再生性在豆科牧草中是最好的，遗传转化效率相对较高，且转基因植株生长速度快。因此，百脉根是研究外源基因转化、生物固氮机理、牧草品质改良的豆科模式植物。尽管有许多优点，但其大多数百脉根栽培品种苗期生长缓慢、抗逆性差，这给产业化生产带来许多不便。因此，在常规育种的基础上，利用生物技术对其加以遗传改良，以培育出优质、高产的新品种，对改良和利用我国大面积的盐碱地和荒漠化土地具有重要意义。液泡膜H+-PPase（V-H+-PPase）是分布于大多数陆生植物细胞中的一种独特的酸化液泡的质子泵2。H

3、+-PPase是植物液泡膜上普遍而丰富的成分,液泡膜H+转运无机焦磷酸酶（H+-PPase）的主要功能有（1）具有质子泵的功能。（2）能够参与蔗糖的生物合成。（3）控制植物生长素的运输。（4）在植物的抗盐胁迫中发挥重要作用 3。孙艳香等人采用EST电子克隆和RACE技术从豆科模式植物百脉根中克隆到一个液泡膜H+-PPase基因的cDNA，命名为LcVP1。该cDNA长为2962bp，含2304bp的完整开放阅读框，编码767个氨基酸，其推测的氨基酸序列与绿豆、拟南芥等I类液泡膜H+-PPase的氨基酸序列同源性在80以上，且有很高的功能区段保守性4 。不同的V-H+-PPase异构体在不同组织

4、和器官中特异性表达，这样可以产生大量的V-H+-PPase。可见，植物不同器官组织V-H+-PPase含量受到有效调节，有利于提高适应胁迫的能力。已有将LcVP1的同源基因AVP1的超表达提高了转基因百脉根的耐盐性 5，但至今还没有将LcVP1基因转入百脉根中改变植株V-H+-PPase活性以提高其耐盐性的相关报道。本研究的目的就是将LcVP1基因转入百脉根获得的转基因植株，其PCR检测呈阳性，对植株盐胁迫处理后，测定其耐盐性。2材料与方法2.1 材料以野生型和经PCR检测阳性转LcVP1基因百脉根为实验材料2.2 方法 首先对崔红敏师姐得到的4株转LcVP1基因百脉根进行了扩繁，将百脉根切断

5、后放入分化培养基中促进其长出丛生苗以达到扩繁增加实验材料的目的。然后进行后续实验。 盐胁迫处理分别取野生型和转基因型的1 cm茎尖转入生根MS无激素培养基。培养基设三个盐浓度分别为0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L，每个组合做3个重复。在盐胁迫期间测定相关指标。2.2.2 指标测定2.2.2.1 地上部分干重在每个处理下，分别取野生型植株和转基因的地上部分，在80 下烘干48 h，称重。2.2.2.2 叶片相对含水量的测定叶片相对含水量（RWC）的测定采用饱和称重法，取百脉根叶片，用无菌水冲洗后，滤纸吸干表面水分，测定鲜重（FW），然后在4的无菌水中浸泡过夜，取出用滤纸

6、吸干表面水分，称出饱和重（TW）,最后转到80烘干至衡重，称得干重（DW），叶片相对含水量=（FW-DW）/(TW-DW)×100%2.2.2.3 MDA含量的测定2.2.2.3.1 MDA含量测定的原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，其最大吸收波长在532 nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450 nm，但532 nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测

7、定植物组织中MDATBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532 nm、450 nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克干重100300 g·g1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5 mol·L-1。（1）直线回归法 MDA与TBA显色反应产物在450 nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(025 mmol·L1)与TBA显色反应产物在450 nm的吸光度值与532 nm和600 nm处的吸光度值之差成正相关，配

8、制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可计算糖分在532 nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532-0.001980.088D450 （2）双组分分光光度计法 据朗伯一比尔定律：DkCL，当液层厚度为1 cm时，kDC，k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的吸光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的吸光度值之和。已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40和7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系

9、数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式： C111.71D450 C26.45（D532D600）0.56D450 C1：可溶性糖的浓度(mmol·L1)； C2：MDA的浓度(mol·L1)； D450、D532、D600分别代表450、532和600 nm波长下的吸光度值。2.2.2.3.2主要仪器设备 752紫外可见分光光度计；离心机；电子天平（0.0001）；研钵；2.2.2.3.3 实验试剂10三氯乙酸(TCA)；0.6硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1 mol·L1)溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英砂。2.2.2.3.4 实

10、验过程取各种处理的叶片0.5 g放入研钵中，加入少许石英砂和2 ml 10%的三氯乙酸（TCA）研成匀浆，将匀浆转移到试管中，再用3 ml 10%的三氯乙酸分两次冲洗研钵，合并匀浆，在提取液中加入5 ml 0.6%的硫代巴比妥酸溶液，摇匀，然后将试管放入沸水中煮沸10 min（自试管中出现小气泡开始记时），到时间后立即将试管放入冷水浴中，待试管冷却后，过滤，量其体积，以0.3%的硫代巴比妥酸溶液为空白，用紫外分光光度计测450 nm，532 nm和600 nm处的吸光度值。2.2.2.3.5 结果计算按公式可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。用双组分分光光度法求得MDA的浓度，根据植物组织

11、的重量计算测定样品中MDA的含量： MDA含量(mol· g-1)=MDA浓度(mol·L-1)×提取液体积(ml)植物组织鲜重(g) 3结果与分析3.1 LcVP1转基因植株的耐盐性高于野生植株由图片（见附录一）可知在没有经过NaCl胁迫生根培养基上的野生型(WT)和转基因型(LcVP1)植株在形态上没有区别，但是在不同浓度的盐胁迫下，转基因植株绿色粗壮，而野生型植株叶黄细高。表明转因植株教野生型植株具有较高的耐盐性。3.2 LcVP1转基因植株的叶片相对含水量高于野生型植株叶片相对含水量的变化能反映出植株耐盐性和抗旱性的强弱，变化较大的植株耐盐性和抗旱性较弱，

12、反之则较强。由图1可以看出，在盐胁迫期间，野生植株和转基因植株的叶片相对含水量都呈下降趋势，但转基因植株叶片相对含水量的变化幅度小于野生型植株，且叶片相对含水量在高盐浓度胁迫下高于野生型。例如，在100 mmolL NaCl下，野生植株的叶片相对含水量下降了53，而转基因植株仅下降了45；这说明，转基因植株在受到盐胁迫时具有较强的保水能力。图1 NaCl胁迫下对野生型和转基因型百脉根叶片相对含水量3.3 LcVP1转基因植株的地上部分干重下降趋势高于野生型植株地上部分干重是显示植物生长状况的指标之一，由图2 可知在盐胁迫期间，野生植株和转基因植株的叶片相对含水量都呈下降趋势，但转基因植株叶片相

13、对含水量的变化幅度小于野生型植株，且叶片相对含水量在高盐浓度胁迫下高于野生型。在100 mmolL NaCl下，野生植株的地上部干重下降了40，而转基因植株的地上部干重仅下降了33。这表明转基因植株在盐胁迫和干旱胁迫下的生长状况要明显好于野生植株。图2 NaCl胁迫对野生型和转基因型百脉根地上部干重的影响3.4 LcVP1转基因植株的细胞膜稳定性高于野生型植株一般说来，耐盐植株和抗旱植株细胞膜系统在盐胁迫和干旱胁迫后受损程度较小，且主要表现在MDA含量较低，细胞膜透性较小，反之，细胞膜受损程度严重。在受到盐胁迫后，野生植株和转基因植株的MDA含量会有所增加，由图3中数据可知，转基因植株的增加幅

14、度较野生植株平缓，且值低于野生型。在100 mmolL NaCl胁迫的处理下，转基因植株的MDA含量增加2.3倍，而野生型植株的MDA含量增加了2.5倍，表明转基因植株细胞膜受损程度轻，其耐盐性较野生型强。 图3 NaCl胁迫对野生型和转基因型百脉根MDA含量的影响4 讨论高盐会对植物造成离子胁迫和渗透胁迫，严重影响了植物正常的生理生化反应，导致植株生长缓慢甚至死亡，然而许多植物在长期盐渍环境中会进化出一系列机制对外界高盐胁迫，在盐渍生境中正常生长。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害时，往往发生膜脂过氧化作用。膜脂过氧化作用的产物比较复杂，包括一些醛类、烃类等。其产物之一丙二醛(MDA) 从膜上产

15、生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，研究中常以MDA含量来反映植物膜脂过氧化的水平和对细胞膜的伤害程度。 转基因植株不仅要进行分子检测以确定其表型性状，如耐盐、抗旱、抗病、抗虫。本研究发现，与野生型植株相比，转基因植株的耐盐性有所提高；随着盐胁迫浓度的增加，转基因植株的MDA含量的增加较野生植株的增加平缓，叶片相对含水量的下降较野生植株的下降平缓。转基因植株的这些优越性是因为H+-PPase的过量表达，使液泡中积累Na+增加，维持了细胞离子平衡，特别是K+和 Na+的平衡，并提

16、高了液泡的渗透能力。目前有关液泡膜V-H+-PPase对盐胁迫的响应有以下两种看法：一是Na+对V-H+-PPase有抑制作用，NaCl胁迫下的V-H+-PPase活性下降。Matsumoto等报道，经200 mmol/L NaCl处理的大麦根V-H+-PPase活性是对照的50，类似现象也在400 mmolL NaCl处理的冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、100 mmolLNaCl处理的绿豆中观察到6。外源Ca2+缓解NaCl对V-H+-PPase的抑制，5mmolL外源Ca2+使100mmolL NaCl胁迫的绿豆根V-H+-PPase活性完全恢复

17、至对照的水平。另一观点是NaCl诱导V-H+-PPase活性活性上升。Colombo等(1993)发现NaCl胁迫增加了胡萝卜悬浮细胞的V-H+-PPase活性7。Ballesteros等发现NaCl胁迫下向日葵幼苗根中的H+-PPase活性比对照略有增加。50 mmolL NaCl处理的胡萝卜细胞V-H+-PPase在10d内较对照增加l倍，80 mmolL NaCl处理的欧亚槭（Acer Pseudoplatanus)细胞H+-PPase也成倍增加8。比较耐盐性不同的两个大麦品种(鉴4和科品7号)V-H+-PPase对不同浓度NaCl(0、100、200 mmolL)的反应，发现耐盐的鉴4

18、在两种盐浓度下，根系、叶片V-H+-PPase水解活性均上升，而不耐盐的科品7号根系、叶片V-H+-PPase水解活性均下降，显示了V-H+-PPase的基因型差异。在100和400 mmolL NaCl胁迫下，盐地碱蓬叶片中V-H+-PPase活性较对照增加9。李平华10的研究表明，用400 mmolL NaCl处理盐地碱蓬后，分离其叶片液泡膜微囊进行Western blot分析发现盐胁迫诱导了盐地碱蓬V-H+-PPase蛋白表达并且其活性明显增大，这与包华音11的研究结果一致。李圆圆121用100 mmolL NaCl处理盐地碱蓬后，其幼叶和成熟叶中V-H+-PPase的水解活性均有所增加

19、。此外，成熟叶中V-H+-ATPase的水解活性要高于幼叶，幼叶中V-H+-PPase水解活性要明显高于成熟叶，这与V-H+-PPase在大多数的幼嫩组织中是液泡膜上主要的质子泵，而在成熟组织中V-H+-ATPase为液泡膜上主要的质子泵的观点一致。VeraEstrella等13用200 mmolL NaCl处理盐芥(The llungiella halophila)后，盐芥叶片中H+-PPase水解活性是未做NaCl处理的1.3倍；Guo等14将盐地碱蓬(Suaeda salsa) H+-PPase基因SsVP转入拟南芥，400 mmolL NaCl处理能够诱导转化植株叶中SsVP的表达。包

20、爱科等3的研究表明高浓度的Na+通常会抑制V-H+-PPase的活性，而低浓度的Na+则会促进V-H+-PPase的活性或提高其转录水平。Na+对V-H+-PPase活性的影响可能是由于Na+竞争酶中K+结合位点而造成的15。因此V-H+-PPase可以作为衡量作物耐盐性的一个指标。由于植物的耐盐性是由多基因控制的复杂性状16，因此同时过量表达多个基因可能比单个基因更能赋予转基因植物更强的耐盐性17。李平华的研究表明，同时过量表达盐地碱蓬Na+H+逆向转运蛋白基因SsNHXl及拟南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVPl的拟南芥植株比野生型拟南芥植株具有更强的抗盐能力10。Zhao等17将盐地碱蓬SsNH

21、Xl及拟南芥AVPl在水稻中同时过量表达，获得的转基因植株比单独过量表达两者之一的转基因植株具有更强的耐盐性； 本实验获得的转基因植株是单独过表达LcVP1基因，植株的抗盐性的提高不是很显著，在后续试验中可以同时转入多个相关外源基因，可能会有赋予转基因植物更强的抗盐性。5.结论在盐胁迫期间，转基因植株的叶片相对含水量、细胞膜稳定性、地上部分干重下降趋势均高于野生型，综上述表明转LcVP1基因百脉根的抗盐性有所提高。参考文献1 孙艳香，杨红梅，耿云红，等根癌农杆菌介导的百脉根遗传转化体系的优化研究J.南开大学学报(自然科学版)，2006，39(2)：51-572 Maeshima M Vacuo

22、lar H+-pyrophosphataseJ.Biochim Biophys Acta. 20001465：37-513 包爱科，张金林，郭正刚，等液泡膜H+-PPase与植物耐盐性J.植物生理学通讯,2006，42(4)：777-7834 孙艳香，王勇.百脉根液泡膜H+-PPase基因的cDNA克隆与分析.植物生理学通讯.2007.43(4):657-6635 程 星AVP1基因转化百脉根及其转基因植株的耐盐抗旱性研究 .硕士学位论文甘肃：兰州大学，20096 Matsumoto HChung G CIncrease in proton-transport activity of tono

23、plast vesicles as an adaptive response of barley roots to NaCl stressJ.Plant Cell Physiol，1988，29(7)：1133-11407 Colombo R，Cerana REnhanced activity of tonoplast pyrophosphatase in NaCIGrown cells of Daucus carotaJ.Journal ofplant physiology,1993，142：226-2298 Ballesteros E，Donaire J P，Belver AEffects

24、 of salt stress on H+-ATPase and H+-PPase activities of tonoplastenriched vesicles isolated from sunflower rootsJ.Plant Physiol，1 996，97：259-2689 Wang B S，Luttge U，Ratajczak REffects of salt treatment and osmotic stress on V-ATPase and V-PPaes in leaves of the halophyte Suaeda salsaJ.Exp Bot，2001，52

25、(365)：2355-236510 李平华盐胁迫下盐地碱蓬液泡膜质子泵表达分析及过量表达SsNHXl-AVPI对拟南芥耐盐性的影响博士学位论文山东：山东师范大学，200311 包华音NaCl胁迫对盐地碱蓬根、茎、叶液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的影响硕士学位论文山东：山东师范大学，200412 李圆圆KCl处理对盐地碱蓬液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的影响硕士学位论文山东：山东师范大学，200513 Vera-Estrella R，Barkla B J，et a1Salt stress in Thellungiella halophila activates N

26、a+ transport mechanisms required for salinity toleranceJ.Plant Physiol，2005，139：1507-1517.14 Guo S L，Yin H B，Zhang X，et al.Molecular cloning and characterization of avacuolar Wpyrophosphatase gene，SsVP，from the halophyte Suaeda salsa and its overexpression increases salt and drought tolerance of ArabidopsisJ.Plant Mol Biol，2006，60：41-5015 Zhen R G Kim E J，Rea P AAcidic residues necessary for pyrophosphate energized pumping a