胶质母细胞瘤紫杉醇增敏放射的体外实验研究

1、    胶质母细胞瘤紫杉醇增敏放射的体外实验研究        摘要目的：通过体外实验评价紫杉醇对胶质母细胞瘤的放射增敏作用。方法：应用人胶质母细胞瘤细胞系BT325。(1)细胞暴露于不同浓度紫杉醇，分别于6、12、24、48、72小时收集标本、作流式细胞术细胞周期分析。(2)细胞经紫杉醇和(或)照射处理后，绘制细胞生长曲线，计算出10%存活率时的放射增敏比(SER)。结果：细胞暴露于紫杉醇后发生了G2-M期阻滞，当紫杉醇作用时间较长或浓度较高时，G2-M期细胞的比率也较高，

2、紫杉醇+照射组的细胞生长受到显著抑制；1、10、100nmol紫杉醇在10%存活率时的SER分别为1.1、1.9、3.0。结论：紫杉醇能将细胞阻滞在对射线最敏感的G2-M期；紫杉醇能增强胶质母细胞瘤的放射生物学效应，值得进一步研究。关键词胶质母细胞瘤紫杉醇放射增敏体外 In vitro studies on radiosensitizing effect of taxol in glioblastoma.Xiu Bo, Duan Guosheng, Liu Zonghui, et al. Dept. of Neurosurgery, Navy General Hospital, Beijing

3、 100037AbstractObjective: To assess the radiosensitisation properties of taxol on human glioblastoma cell line in vitro. Methods: A human glioblastoma cell line, BT325, was used for this experiment. (1) Cells were exposed to taxol at different concentrations for 6, 12, 24, 48 and 72h after which cel

4、l cycle analysis was performed with flow cytometer. (2) The cells were treated with taxol or/and radiation (RT). Growth curves were drawn and sensitizer enhancement ratios (SER) were evaluated. Results: The cells developed a G2-M block after exposure to taxol. The percentage of the cell population i

5、n G2-M was higher at longer taxol exposure time and at higher taxol concentration. The cell growth for taxol plus RT was significantly inhibited. The SERs at 10% survival for 1, 10 and 100nmol taxol were 1.1, 1.9 and 3.0, respectively. Conclusion: Taxol can block tumor cells in G2-M which are the mo

6、st radiosensitive phases. The results that taxol enhances effect of RT on glioblastoma in vitro suggest taxol may be a promising radiosensitive agent for glioblastoma.Key wordsGlioblastomaTaxolRadiosensitizing In vitro恶性胶质瘤手术难以全切，极易复发。而常规放疗的效果亦不够满意，主要原因是某些肿瘤细胞对放射线不敏感（1，2）。一些肿瘤学家试应用放射增敏剂来提高肿瘤的放射敏感性，有

7、的改善了胶质瘤患者的生存期和生存质量（3）。紫杉醇(taxol)是一种新型抗癌药。近年来发现，它除具有抗癌活性外，还可增强某些肿瘤的放射效应。本实验旨在通过体外实验评价紫杉醇对脑胶质母细胞瘤的放射增敏效应并探讨其作用机制。材料与方法一、材料1. 人脑胶质母细胞瘤细胞系BT-325（4）。2. 紫杉醇(美国Sigma公司)。3. IM DM培养基，内含15%新生牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100g/ml。4.DNA荧光探针碘化丙啶(PI，美国Sigma公司)。5. 流式细胞仪(FACS420，美国BD公司)。6. 直线加速器(美国varian,clinacl800)，X线，8MeV，剂量

8、率400cGy/min。二、方法1. 紫杉醇对细胞周期的影响：将对数生长期的肿瘤细胞5×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，贴壁培养24小时后，更换含有不同浓度(1、10、100、1000nmol)紫杉醇的培养液10ml。分别于给药后6、12、24、48、72小时收集细胞，制成单细胞悬液，用RNA酶消化，PI染色，尼龙网过滤标本，上机检测。每分标本至少检测1万个细胞，测出细胞周期分布百分率。每个紫杉醇浓度组为两瓶培养，重复一次实验，取检测结果的平均值。2.生长抑制试验：(1)细胞生长曲线：将培养细胞分成对照组、紫杉醇组、照射组及紫杉醇+照射组。将5×105个对数生长期细胞

9、接种于25cm2培养瓶中，贴壁培养24小时。紫杉醇组和紫杉醇+照射组更换含有10nmol紫杉醇的培养基5ml，另两组则仍用IMDM培养液5ml，继续培养24小时。照射组和紫杉醇+照射组用直线加速器照射6Gy。照射后立即收集各组培养细胞，用台盼蓝排除法计算细胞活力。将105个活细胞接种于25cm2培养瓶，加入不含紫杉醇的培养液。照射后每日每组抽取3瓶细胞，活细胞计数，求平均值，至照射后第5天结束实验，绘制细胞生长曲线。(2)生存分析：培养细胞分组同上。紫杉醇组和紫杉醇+照射组分别加入含有1nmol、10nmol、100nmol、1000nmol紫杉醇的培养基5ml，对照组和照射组则仍用IMDM培

10、养液5ml，培养24小时。单纯照射组和紫杉醇+照射组用直线加速器分别照射2、4、6、8、10Gy。照射后立即收集各组培养细胞，在带格的6cm平皿中接种活细胞(接种细胞数目要使形成的集落数达到100200个)，培养14天，细胞固定、染色，显微镜下计数含有50个细胞的集落，计算细胞存活率(SF)SF=(处理组集落形成数接种细胞数)/(对照组集落形成数接种细胞数)每组3皿，实验两次，结果取平均值，绘制放射生存曲线；由生存曲线计算出紫杉醇+照射组在10%存活率水平时的放射增敏比(SER)。结果一、流式细胞术细胞周期分析(见附表)附表BT325细胞暴露于紫杉醇后的细胞周期时相分布时间(h)紫杉醇(nmo

11、l)细胞周期时相(%)G1SG2-M0054301661522919104626281003730321000462925121473221102837351001835471000551629241175033101413731001098110001723604812841311012107810061183100063163721313237101417691001612721000529661经紫杉醇及照射处理后的细胞生长曲线2BT325细胞经不同浓度紫杉醇处理后的放射生存曲线A.相对于对照组的生存曲线B.相对于紫杉醇组的生存曲线二、细胞生长抑制实验1. 细胞生长曲线见1。2. 生存分

12、析：经紫杉醇和(或)照射处理的细胞存活率见2。1000nmol紫杉醇+照射组的集落形成数过少，无法计算细胞存活率，由2B可以测得在10%细胞存活率水平上，1nmol、10nmol、100nmol紫杉醇的SER分别为1.1、1.9、3.0。 讨论一、紫杉醇放射增敏的机理细胞动力学研究表明：增殖细胞大多数处于G1-S期，而这两个时相的细胞恰恰具有抗放射线性质（2，5）。因此，促使其肿瘤G1-S期细胞进入并停留在对放射线敏感的G2-M期，是提高肿瘤放射敏感性、改善疗效的一个重要途径（2，3，6）。在细胞增殖周期中，紫杉醇与微管亚单位中的微管蛋白牢固结合，促进微管聚合，抑制着丝点微管解聚，从而阻止染色

13、体的移动及去极化，使细胞阻滞在晚G2-M期（7），这可能是紫杉醇增强肿瘤细胞放射效应的重要机理之一。本实验对BT-325细胞进行细胞周期分析，证实紫杉醇具有很强的G2-M期阻滞作用，G2-M期细胞比率最高可达83%。二、紫杉醇的时间、浓度依赖效应如何应用紫杉醇以获得最佳的增敏作用，是临床上的一个重要问题。本实验结果表明，紫杉醇的G2-M期阻滞作用呈时间依赖性。紫杉醇作用2472小时的G2-M期细胞组分明显高于药物作用612小时者，但作用时间24、48、72小时之间效应相差较小。我们认为，药物作用时间接近一个细胞增殖周期(Tc)，即可获得较高的G2-M期效应。因此，临床上肿瘤的每次照射时间点最好

14、选定在紫杉醇作用约一个Tc后。人类肿瘤的Tc一般为数十小时。本实验结果还表明：在确定的药物作用时间内，紫杉醇浓度较高时，G2-M期细胞组分亦较大。但1000nmol时的G2-M期细胞组分低于10nmol和100nmol时的组分。根据文献报道（8）及我们的实验结果，推测出现这种现象的原因可能是，过高浓度的紫杉醇可阻滞细胞于G1-S期或直接导致部分G2-M期细胞死亡。三、紫杉醇增敏放射的生物学效应细胞生长抑制试验显示：单纯照射时BT325瘤细胞具有一定的抗放射性；紫杉醇和放射合用可获得协同作用，对人胶质母细胞瘤细胞系BT325的抑制和杀死作用明显优于单纯照射或单用紫杉醇；随着合用紫杉醇浓度的增大，

15、细胞存活率明显降低。在10%细胞存活率水平时，紫杉醇的SER很高，表明紫杉醇的放射增敏效应显著，提示值得进一步研究。作者单位：100037北京，海军总医院神经外科(修波、刘宗惠)；军医进修学院(段国升、薛毅珑)参考文献1Prados MD, Wilsn CG. Neoplasms of the central nervous system. In: Holland JF, et al. eds. Cancer medicine. Philadelphia:Lea & febiger, 1993:1091-1094.2谷铣之，殷蔚伯，刘泰福,等主编.肿瘤放射治疗学.北京：北京医科大学中国

16、协和医科大学联合出版社.1993:242-256,280-285.3修波.恶性脑瘤增敏放疗进展.国外医学肿瘤学分册，1992:19(增刊)：91-93.4邵文钊.人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系BT325.细胞生物学杂志，1985，7：92.5范朗娣，王开伟，张惹英，等.流式细胞仪对星形细胞肿瘤的评价.中国肿瘤临床，1994，21：90-92.6Rubin LL, Philpott KL, Brooks SF. The cell cycle and cell death. Curr Biol, 1993, 3:391-394.7Foa R, Norton L, Seidman AD. Taxol (paclitaxel): a novel investigational antimicrotubule agen