mRNA及蛋白质的检测分析技术

1、mRNA及蛋白质的检测分析技术    mRNA及蛋白质的检测分析技术移植肾损伤的分子病理学研究已经超出局部病理变化的范畴,正在向局部分子改变和组织学改变相结合、代写硕士论文局部分子改变与体液分子改变及血细胞分子改变相结合的多元化分子研究发展1。目前研究分子病理的常用方法普遍适用于移植肾损伤的分子病理学研究。  1.DNA检测分析技术分子生物学技术的发展,使人们对移植免疫等方面参与移植肾损伤的分子的核苷酸碱基序列的了解越来越清楚。体外基因扩增技术PCR方法的创立及其在生物医学中的应用,使得从DNA水平研究移植肾损伤成为可能,并已在临床器官移植研究

2、中实际应用。检测DNA的方法多种多样,根据不同的用途各有其特点。目前常用的可大致归纳为如下几大类型2。1.1Southern印迹法(Southern blot)将一定量的DNA样品用适当的限制性内切酶切割成不同长度的DNA片段,然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离,如加样量相等,酶解适当,则在用溴化乙锭染色时,应显示长度及亮度均相等的DNA拖带。用于检测DNA的已知探针,一般由带有该片段的细菌质粒中制备。纯化的探针DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等标记。杂交前探针必须加温至100变性处理。杂交后的膜在暗盒中进行放射自显影后,即在一定的位置显示同标记探针特异地结合的阳性DNA条带。S

3、outhern杂交法可检测基因的存在及其扩增,也可检测基因的杂合性丢失。1.2聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术PCR是一种由特定寡核苷酸引物(primer)介导的特异基因或克隆序列的体外酶促扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。该方法一改传统分子克隆技术的模式,不通过活细胞,操作简便,可以将数量很少的原始模板DNA分子进行几何级数的倍增,扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定,能最大程度地满足科学家操作DNA的要求。因此,在其问世后的十多年里,PCR技术得到了迅速发展。在经典PCR基础上发展了RT-PCR,

4、以RNA为模板,首先逆转录成cDNA,然后进行正常PCR循环扩增。近年来,PCR技术得到进一步发展,并建立了一系列PCR扩增新技术,如反向-PCR、锚定-PCR、原位-PCR、巢式-PCR、重组-PCR、定量-PCR等。据此,在移植肾损伤的分子机制研究中,利用很少的活检组织细胞或体液,在获取少量模板DNA的情况下,即可应用PCR技术研究待测基因的表达。1.3聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法(PCR with seqequence-specific oligonucleotide probe, PCR-SSO)PCR-SSO主要技术包括提取模板DNA,以位点间或组间特异引物进行PCR扩增,其产物

5、转移到NC膜上。再与数十个寡核苷酸特异性探针杂交,从而分辨出等位基因的特异性。近年来,PCR-SSO的方法学研究有许多改进,标记探针亦多种多样。归纳起来可分两大类:放射性标记,主要是32P标记;非放射性标记,常见的有酶类、地高辛、生物素、荧光素或化学发光剂等,采用PCR-SSO从DNA水平研究移植肾损伤机制已经广泛应用。1.4聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR with signgle strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)PCR-SSCP系Drita等1989年首先提出,其原理可概括为:在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,单链DNA因

6、碱基序列不同所形成的构象不同。通过PCR扩增包括发生单个碱基置换部位及两侧DNA片段,变性后进行SSCP分析,从理论上讲可分辨出单个碱基的改变,有效地检出点突变和DNA的多态性,并且已经用于肾移植术后排斥反应的分子病理研究3。1.5顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR with sequence-specific primers, PCR-SSP)PCR-SSP方法的基本原理是根据待测基因的核苷酸序列,设计出一系列针对各亚型的顺序特异引物,通过PCR扩增各等位基因的型别特异性DNA片段;扩增产物仅需借助常规的琼脂糖凝胶电泳,即可根据是否存在特异性扩增产物的电泳条带直接进行基因检测。1.6原位聚

7、合酶链反应(in situ PCR)利用PCR技术,不仅可以在聚丙烯管中对含有多种模板的材料进行PCR,也可以在病理切片或细胞显微波片上对标本进行待测基因的DNA原位扩增,可称为玻片PCR(Slide-PCR)。其特点是不经过模板提取过程,在组织或细胞原位进行PCR扩增,要求在具备原位PCR扩增条件的PCR仪和原位扩增系统中进行,扩增物可作原位杂交显示,可以结合病理组织学分析,判定病理改变与某个或某些基因的关系。  2.mRNA检测分析技术2.1原位杂交技术原位杂交(in situ hybridization, ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸

8、按碱基配对的原则进行特异结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法,在核酸原有的位置进行细胞内定位。是研究单一细胞中编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位的手段,是从分子水平研究细胞内基因表达及其调控的有效工具。适用于肾移植后不同病理损伤的mRNA表达的研究及检测,具有定位准确,病理分析与分子改变同步显示的功能。22Northern印迹法Northern印迹(Northern blot)原理与Southern blot基本相同。所不同处在于,RNA远不如DNA稳定,很容易被RNA酶降解,而RNA酶不仅广泛存在,而且加热至100也不能使其灭活,所以在操作

9、RNA时所用的一切器皿和溶液都必需经过严格的消除RNA酶的处理。Northern印迹主要应用于检测相关基因的过度表达,也可检测基因的低表达或不表达。2.3RT-PCR技术(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)RT-PCR已经成为研究器官、组织或细胞中mRNA转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT-PCR的基本步骤包括:提取样品mRNA合成一个cDNA拷贝,接着扩增感兴趣的基因。通常因两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容,所以这两个步骤(RT和PCR)分别进行。最近一种全新试剂盒,使RT-PCR可以通过一步法完成更加快

10、速有效,而在两步法实验中可以获得更高的灵敏度。  3.蛋白质检测分析技术DNA是生物信息的提供者,而蛋白质在细胞中完成了所有的工作。特定DNA序列的存在并不能保证与之相应的蛋白的合成。DNA序        列并不足以描述蛋白的结构、功能和在细胞中的位置。实际上,蛋白激活的信号途径可以立即引起一个细胞的迁移、死亡或开始分裂,而此时可能DNA/RNA基因表达等还没开始发生变化。因此,推动移植肾损伤的分子病理学研究技术应来自于蛋白分析的方法。3.1免疫组织化学方法(immunohistochemistry)随

11、着免疫学的理论和技术的发展,基于免疫学的核心抗原抗体结合这一原理,免疫组织化学技术从组织细胞水平进行抗原抗体反应,使免疫学技术与病理形态学有机结合。免疫组化的优点为:(1)特异性强:由于免疫学的基本原理是抗原与抗体的“一对一”的特异结合,因此,免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示,只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。(2)敏感性高:现在由于ABC法或SP法的出现,使抗体稀释成千上万倍仍可在组织细胞中与抗原结合,这样高敏感性的抗体抗原反应,使免疫组织化学的方法越来越方便地用于常规诊断工作中。(3)定位准确、形态与功能相结合,可在组织和细胞中进行抗原的准确定位

12、,可以进行形态与功能相结合的研究,对病理学研究的深入十分有意义。免疫组织化学方法是病理学研究中最早引入的分子生物学技术,已经在移植肾排斥反应的分子诊断中得到广泛应用,为探索移植免疫病理改变和病变局部参与免疫排斥相关分子表达的研究以及在慢性移植肾病肾损伤中的分子表达的研究作出重要贡献2,3。3.2蛋白印迹(Western blot)方法是将用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上,在其上进行抗原抗体反应,检测出目的成分。以此确定目的蛋白的存在与否,并可以看出表达量的差异,据此研究所关心的目的基因的表达情况。用于检测由基因扩增所致的产物过表达,不仅能检出蛋白质量的变化,而且能获取更多

13、的生物学信息。  4.生物芯片技术生物芯片是近10年在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。它主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统,以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为三大类:即基因芯片(Gene chip,DNA chip,DNAmicroarray)、蛋白芯片(Protein chip)、芯片实验室(Lab on a chip)等。生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片上高度集成的成千上万密集排列的分子微阵列,能够在很短时间内分析大量的生物分子,使人们

14、能够快速准确地获取样品中的生物信息,检测效率是传统检测手段的成百上千倍5。生物芯片技术将改变生命科学的研究方式,革新医学诊断和治疗,极大地提高人口素质和健康水平。生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势,它可以在一张芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测。仅用极小量的样品,在极短时间内,向医务人员提供大量的疾病诊断信息,这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。生物芯片技术的深入研究和广泛应用,将对移植免疫的分子病理研究产生极其深远的影响1,6。采用高通量生物芯片技术可以充分反映移植组织遭受急性排斥反应攻击时的基因表达以及蛋白质的差异表达。对急性排斥反应时细胞毒性T细胞效应分子如:INF

15、刺激生长因子-3(interferon-stimulated growth factor-3)、补体因子3、烟碱-甲基转移酶(nicotinamide N-methyltransferase)、巨噬细胞趋化蛋白3、以及骨髓由来的不同蛋白、CD18等多种因子基因表达进行检测。因为这种方法不仅局限于原有的已知的几个与AR有关的基因,很可能在排斥反应发生机制和诊断方面,提高对参与排斥反应基因表达和更多生物学信息的研究,籍此发现新的生物学标志物7,为今后早期诊断排斥反应和制定治疗方案提供帮助。  5.激光捕获显微分离技术(Laser capture microdissection-LCM)在进行移植肾损伤的分子病理学研究中,解决不同组织干扰问题需要新技术的支持,显微分离技术可以来协助克服这一问题。由于激光捕获显微分离技术(Laser capture micro-dissection, LCM)可