电刺激大鼠黑质网状部对脚桥核神经元自发放电的影响

1、    电刺激大鼠黑质网状部对脚桥核神经元自发放电的影响郑 贺，林宇涵，李靖远，高东明*(辽宁医学院生理学教研室，锦州 121000)摘要 目的：观察电刺激大鼠黑质网状部(substantia nigra pars reticulata，SNr)对脚桥核(pedunculopontine nucleus，PPN)神经元自发放电活动的影响，进一步探讨脑内电刺激治疗帕金森病(Parkinsons disease，PD)的机制。方法：应用细胞外记录方法观察不同频率电刺激大鼠SNr对PPN神经元自发放电的影响。结果：实验记录了大鼠46个PPN神经元的自发放电，其

2、放电频率在2.455.4 Hz之间，平均为(21.3±13.8) Hz;低频电刺激(510 Hz)大鼠SNr时，PPN神经元的自发放电无明显变化(P>0.05)，随着刺激频率(20200 Hz)的增加，大多数PPN神经元的自发放电活动受抑制，神经元放电频率较刺激前明显降低，且在100 Hz时的抑制作用最强(P<0.05)。结论：高频电刺激大鼠SNr对PPN神经元自发放电的影响主要为抑制，提示高频电刺激SNr可通过抑制PPN神经元活动参与PD的治疗。关键词 脚桥核;黑质网状部;电刺激;帕金森病Effect of electrical stimulation of the s

3、ubstantia nigra pars reticulata on the neuronal activities of pedunculopontine nucleus in ratsZheng He, Lin Yuhan, Li Jingyuan, Gao Dongming(Department of Physiology, Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, China)AbstractObjective: To study the effect of electrical stimulation of the substantia ni

4、gra pars reticulate (SNr) on the neuronal activities of pedunculopontine nucleus(PPN)in rats，furthering the mechanism of deep brain stimulation in the treatment of Parkinsons disease. Methods: Electrophysiological recordings were made in anaesthetized rats to investigate the effects of SNr electrica

5、l stimulation with different frequencies on the firing rate of the PPN neurons. Results: For SNr stimulation at low frequency (5-10Hz), there was no effect on the spontaneous firing activities of PPN neurons (P>0.05). With the increase of stimulation frequency(20-200Hz), the majority of neurons r

6、ecorded in the PPN were inhibited. Conclusion: High frequency stimulation of the SNr induced an obvious decrease in activity of most neurons recorded in the PPN. The present data provide foundation for future investigations afferent pathways of SNr-PPN in the treatment of Parkinsons disease.Keywords

7、pedunculopontine nucleus;substantia nigra pars reticulata;electrical stimulation;Parkinsons disease帕金森病(Parkinsons disease，PD)是中老年人常见的神经系统退行性病变。现已明确，PD是由中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失引起的。运动迟缓、静止震颤、肌肉僵硬和步态障碍等是PD典型的临床表现。目前，高频电刺激丘脑底核(subthalamic nucleus，STN )、苍白球(globus pallidus，GP)等基底神经节核团是功能神经外科治疗PD的首选方法1，但是这一方法对步态

8、障碍、静止震颤等临床症状的改善并不理想。近些年的研究发现，PD的产生常伴随脑干核团，尤其是脚桥核(PPN)的功能紊乱2,3。而电刺激PPN可改善PD的步态障碍等症状，很可能成为治疗PD新的刺激靶点4,5，但其机制仍不清楚。鉴于基底神经节，尤其是黑质(substantia nigra，SN)等核团与PPN存在密切的功能联系6，本实验采用电生理学方法，观察不同频率电刺激大鼠SNr对PPN神经元自发放电的影响，进一步探讨SNr-PPN传入神经通路在PD发病机制和治疗中的作用。材料和方法1 材料实验选用成年Sprague-Dawley雄性大鼠6只，体重250300g，由辽宁医学院实验动物中心提供。2

9、方法2.1 动物手术及电刺激 用20%氨基甲酸乙酯(0.8ml/100g体重)腹腔注射麻醉大鼠后，颅平位固定于脑立体定位仪上，行常规开颅术暴露皮层。依据Paxions & Watson大鼠脑图谱，将刺激电极(NEX100同心圆电极，外径0.25mm，直流阻抗36M)推入SNr(坐标为 AP -5.5mm，LR 2.0mm，H 7.9mm)，为避免刺激电极与记录电极发生冲撞，将刺激电极由左向右倾斜16°。电刺激采用A320R型隔离刺激器(美国WPI公司)，观察在不同刺激频率下PPN神经元自发放电活动的变化。刺激参数为：单脉冲，强度0.6mA，波宽0.06 ms，刺激时程5s，刺

10、激频率分别为5、10、20、50、100、150、200 Hz。2.2 细胞外记录 采用自制单管玻璃微电极进行PPN神经元放电的细胞外记录，电极尖端直径12 m，电阻510M，管内充以含1%滂胺天蓝的3.0 mol/L NaCl溶液。借助微电极推进器将玻璃微电极缓缓推入PPN(坐标为AP -7.8mm，LR 1.62.0 mm，H 6.37.0 mm)。神经元单位放电经DAM80微电极放大器(美国WPI公司)采集、滤波并显示于示波器上，再经Spike2生物信号采集系统(英国CED公司)输入计算机进行处理，生成序列密度直方图。实验过程中只对放电稳定且信噪比>3/1的神经元放电信号进行记录。

11、2.3 组织学检测 每次实验记录后，经玻璃微电极电泳滂胺天蓝(-20A，20min)标记记录部位，刺激部位采用直流电(+20 mA，20s)损毁法标记。标记结束后分别用生理盐水和含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液各50 ml，经颈动脉灌流行前固定后，迅速取出完整的脑组织，放入同样的固定液中进行固定，时间不少于3 h，再将脑组织移入30%的蔗糖磷酸缓冲液(pH=7.4)过夜，沉底后即可行冰冻切片，片厚30 m，焦油紫染色，光镜下观察进行组织学鉴定。只对记录和刺激部位均正确的数据进行统计学处理(Fig .1)。Fig. 1 Labelling of extracellular record

12、ing site in PPN of a rat. A: The Cresyl violet-stained coronal section through the PPN and the arrow points to the PPN labelled by pontamine sky blue. B: The figure from the Rat Brain Atlas (Paxions &Watson) showing the corresponding of the labelling site. CnF: cuneiform nucleus; scp: superior c

13、erebellar peduncle; SPTg subpedencular tegmental nucleus; PPN: pedunculopontine nucleus. Bar = 200 m.统计学处理： 给予5200Hz电刺激后，可将PPN神经元的反应分为：兴奋型反应，抑制型反应和无反应三种类型。根据下面公式判定神经元对电刺激的反应：R=(刺激后放电频率/刺激前放电频率-1)×100%，将R20%定义为兴奋型反应，R-20%为抑制型反应，介于两者之间为无反应型。所得数据应用SPSS11.5统计软件处理，神经元的平均放电频率以均数±标准误(¯x±

14、;s¯x)表示，施加各处理因素前后差异比较采用配对 t 检验。结 果1 正常大鼠PPN神经元的自发放电本实验在SD大鼠共记录了46个PPN神经元的自发放电活动，其放电频率在2.455.4Hz之间，平均为(21.3±13.8)Hz。PPN神经元表现为三种放电形式(Fig 2)：其中60.87%的神经元为规则放电(28/46)，32.61%为不规则放电(15/46)，少见爆发式放电(6.52%，3/46)。Fig. 2Firing patterns of PPN neurons in rats. LH: Primitive waveform(A: Regular firing;

15、 B: Irregular firing; C: Burst firing);Middle：Extracellular action potential of PPN neurons; RT: Interval histogram. Bin time is one second.2 不同频率电刺激SNr对PPN神经元自发放电的影响实验观察了给予大鼠SNr不同频率的电刺激(5、10、20、50、100、150、200 Hz )对46个PPN神经元自发放电的影响。结果显示，低频电刺激(510Hz)大鼠SNr时，PPN神经元的自发放电无明显变化(P>0.05)。随着刺激频率(20200Hz)的

16、增加，电刺激SNr对PPN神经元放电活动的影响表现为放电频率的减少、增多和无明显变化三种形式(表1)。电刺激SNr可抑制大多数PPN神经元的自发放电活动(Fig3)，而兴奋少数PPN神经元的放电活动(Fig.3)。电刺激SNr对PPN神经元自发放电频率的影响随刺激频率的加快而增大;当刺激频率为100Hz时，PPN神经元放电频率的变化最显著， 46个PPN神经元中有28个神经元(60.87%)表现为抑制反应，平均放电抑制率达60%以上(Fig.4);13个为兴奋反应(28.26%)，仅有5个神经元无明显反应(表1)。Fig. 3 Effects of electrical stimulation

17、 of the SNr with different frequencies on the firing rate of a PPN neuron in a rat. A: inhibitory effects; B: Excitatory effects. (a): sequence histogram; (b): original chart recording. The bars on the top of the figure indicate the period of electrical stimulation of SNr.Fig .4 Relationship between

18、 inhibitory responses of PPN neurons and stimulation frequency of SNr.讨 论作为脑干躯体运动控制中心的PPN是一个呈柱形的神经核团，位于中脑被盖下半的腹外侧部，楔形核和楔形下核的腹侧，小脑上脚的外侧，内侧丘系的内侧和背侧，其下方为臂旁核，它与基底神经节尤其是黑质有非常紧密的联系。PPN同纹状体、SNr、黑质致密部(SNc)、苍白球内侧部(GPi)、苍白球外侧部(GPe)以及STN之间均有纤维投射。PPN通过发出到黑质和STN的传出纤维而直接控制基底节环路，并向丘脑运动核团发出投射，再由这些神经元发出投射到纹状体和额叶皮质而间

19、接起作用。PPN到双侧STN有大量的兴奋性胆碱能或谷氨酸能投射。SN到PPN的传入纤维主要起源于SNc的外侧和SNr的尾侧，与PPN的谷氨酸能神经元胞体和周围树突形成突触联系，还有少量的纤维末梢终止于胆碱能神经元7 。PPN发出的下行投射纤维至脑桥延髓网状结构和脊髓。动物研究表明PPN在运动的起始、加速、减速和终止过程中起重要作用8。研究发现，PPN的黑质纤维末梢主要是-氨基丁酸能递质，电刺激黑质后在PPN的胆碱能和非胆碱能神经元胞体内都记录到抑制性突触后电位9。本实验结果显示，20Hz以上频率电刺激SNr，可见PPN神经元的放电频率有兴奋和抑制两种改变，但以抑制作用为主，即大多数PPN神经元

20、的自发放电活动受抑制，且在100 Hz时的抑制作用最强。解剖学研究证实SNr的GABA能神经纤维直接投射到PPN，而微电泳GABA可抑制PPN神经元的放电活动，并具有紧张性作用10。依此可推测电刺激SNr时，由于GABA释放增多，增加了对PPN的抑制性驱动，从而抑制了PPN神经元的活动，使其放电频率降低。抑制PPN神经元可抑制向苍白球发出投射的STN神经元，导致STN神经元活动降低，STN兴奋性输出减少，从而抑制了基底神经节的输出，达到改善PD运动障碍的作用。在正常大鼠PPN也可能通过多突触传递，经SNc的间接影响，对STN 起抑制性的调节作用11。另外，束旁核有到STN、纹状体和苍白球的兴奋

21、性投射，PPN也可能通过脚桥核-束旁核间接通路来调节STN的活动12 。本实验结果表明高频电刺激大鼠SNr对PPN神经元自发放电的影响主要为抑制，代谢研究也显示，PD模型鼠和猴PPN的2-脱氧葡萄糖重吸收增加，反映了STN的兴奋性递质和GPi/ SNr的抑制性递质在PPN的作用增强13。近年来，不断有PD状态下PPN的放电频率增加的报道，和PD鼠PPN的mRNA细胞色素氧化酶过度表达相一致14，提示SNr-PPN传入神经通路活动的改变参与PD的发病和治疗。但该神经通路中参与调控的神经递质和受体有待进一步深入研究。参考文献1 Benabid AL, Chabardes S, Torres N,

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