测定胰岛素一级结构的方案

1、测定胰岛素一级结构的方案标题：测定胰岛素一级结构的方案姓名:学号:院系:专业:提交时间：2012 年 11 月 19 日星期一摘要：研究蛋白质结构与功能关系是目前分子生物学的重大课题之一，1953年，英国生物化学家 Fred Sanger 报道了胰岛素（insulin）的一级结构，同年，Watson 与 Crick 发现 DNA 的双螺旋结构。1969 年，基本与应用化学联合会规定 以各种氨基酸按一定顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质基本结构。测定 蛋白质（胰岛素）结构，主要要测定出：多肽链的数目；每条多肽链末端氨基 酸的种类；每条肽链上氨基酸的种类，数目及连接顺序；链内于连间二硫键的 数目

2、与位置。至此，一种蛋白质的结构已基本明确。关键字：胰岛素一级结构测定方法化学法与酶解法1953 年，英国生物化学家 Fred San ger 报 道了胰岛素（insulin）的一级结构，这是世界上 第一个被确定一级结构的蛋白质。同年，Watson与 Crick 发现 DNA 的双螺旋结构。生物化学由此 迈向了一个更高层次一一分子生物学时代。胰岛素的一级结构由 51 个氨基酸残基组成分两条链：A 链：21 个氨基酸残基B 链：30 个氨基酸残基含三个二硫链：一个 A 链内的二硫两个链间二硫键GinGy 3-Tn r- SGys-S&r-L6J-Tr-G in LCuG LiA SOTyr

3、- Gy-A 3 HHis-L&v-Cya-Giy-Ser -H is-Leu-vai-G-Aii-Lej- Ty-Leu-vai-Cy&CHAIN CAsnVairhF-LysPfo-rhF-ryr-Ph&- Phe-GlyHUMAN INSULIN胰岛素的功能:胰岛素是由胰岛3细胞分泌的一种 蛋白质类激素促进肌肉、脂肪组织细胞 膜对葡萄糖的通透性诱导、促进肝脏葡萄糖激酶等合成，增强 糖的分解代谢促进肝、肌肉中糖原合成GtyCHAIN/GiyPhfeIIQVai抑制糖异生 促进糖转变为脂肪抑制脂肪分解人与各种动物胰岛素一级结构比较表：一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异名

4、称AAAioB30与人的差异数活性人苏氨酸丝氨酸异亮氨酸苏氨酸-猪-丙氨酸1抹香鲸-丙氨酸1马-甘氨酸丙氨酸2象-甘氨酸缬氨酸2牛丙氨酸-缬氨酸丙氨酸3蛋白质分子的一级结构测定， 概括起来 包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺 序分析以及S S定位等。1.多肽链的分离在测定一个蛋白质的结构以前，首先必须 保证被测蛋白质的纯度，使结果准确可靠。其次 要了解它的分子量和亚基数， 按照其亚基数将蛋 白质分成几个多肽链。1）肽链的拆开胰岛素分子多肽链的连接有共价结合和非 共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接 的多肽链，采用的方法：巯基乙醇还原：利用还原剂巯基乙醇亦可 使蛋白质的-S-S-断

5、裂。 当高浓度的巯基乙醇在 pH8 条件下室温保温几小时后，可以使-S-S-定 量还原为桽 H。与此同时反应系统中还需要有 8 摩尔脲或 6 摩尔盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松 散成为无规则的构型，此时还原剂就可作用于 -S-S-。此反应是可逆的，因此要使反应完全， 疏基乙醇的浓度必需在 0.1-0.5 摩尔。2）末端分析（1）N-末端测定：二甲基氨基萘磺酰氯法：1956 年 Hartley 等报告了一种测定 N-末端的灵敏方法，采用 1- 二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。它与 游离氨基末端作用，方法类似于 San ger 的 DNFB 法（二硝基氟苯法（FDNB DNFB） 1945

6、年 San ger 提出此方法，是他的重要贡献之一。DNP 氨基酸 用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何 种氨基酸。 Sanger 用此方法测定了胰岛素的 N 末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。），产物是磺酰 胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高（比 FDN 醛提高 100 倍，样 品量小于1毫微克分子） 及丹磺酰氨基酸稳定性 较高 （对酸水解稳定性较 DNP 氨基酸高），可用 纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。（2）C-末端分析：肼解法：这是测定 C-末端最常用的方法。 将多肽溶于无水肼中，100C 下进行反应，结果 羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放， 而其余肽 链部分与肼

7、生成氨基酸肼。 这样羧基末端氨基酸 可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出 而进行分析。 如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰 胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游 离的羧基末端氨基酸。 此外肼解时注意避免任何 少量的水解， 以免释出的氨基酸混淆末端分析。3）氨基酸组成分析在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先 应了解它是由那几种氨基酸组成的， 每种氨基酸 有多少？分析组成的方法有：离子交换层析法：Spaekman 等发展了一 种精确的氨基酸组分的定量方法。 他们采用磺酸 型的离子交换树脂，这是一种高分子量的固体聚 苯乙烯，带有大量的功能基团，磺酸基在低 pH 和低离子强度条件下，根据氨基

8、酸的酸碱性，氨 基酸带正电，于是替换下树脂上的 N6，借助静 电作用而结合到磺酸基上。由于各种氨基酸在树脂上的亲和力不同，因 此当改变溶液 pH 和离子强度，便可依次将它们 洗脱下来而分开，并进行定量测定。在此基础上 发展了氨基酸自动分析仪。随着科学技术的日益 进展，氨基酸自动分析仪在样品的用量， 分离速 度及检测能力上也有了很大的提高。 目前最好的 仪器样品分析量只要几十 Picomole,分析时间只 要数十分钟，而且计算全部自动化，给研究蛋白 质一级结构带来了极大的方便。2.多肽链的降解多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂，因此直 接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的， 多采用 将多肽链进一步降

9、解成为更小的片段，然后再行 分析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要 问题， 它要求裂解点少，选择性强，而且反应产 率高，目前主要有化学法和酶解法两类。化学法溴化氰法：是最理想的化学方法，能选择 性断裂甲硫氨酸所在的肽键溴化氢化学降解法其优点：1一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得 大片段；2专一性强；3产率高达 80%以上;4作用条件温和，在室温中用几到十几小时 即可。3.肽段的分离大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸 等有机溶剂使之溶解。4.肽的顺序分析酶解法:分析肽段也可采用酶解法，利 用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂 成更小的寡肽，比

10、较两种方法所得之肽段的 重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十 肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡 肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套 寡肽。分析结果如下：Ala Phe+Gly Lys Asn Tyr+Arg Trp+His Val糜蛋白酶水解+肽(Ala Phe Gly Lys Asn Tyr Arg T rp His Val)胰蛋白酶水解Ala Phe Gly Lys+Asa - Tyr Arg+T rp His Val将此两套寡肽可以做分析比较，因为十 肽的N 末端及 C 末端已事先测定分别为 Ala 及 Val，因此第一段寡肽必然是 Al

11、a,Phe。如此类推如下氨基酸组成部分顺序号A-1Ala PhaB-1Ala Phe Gly LysA-2Gly Lys Asn TyrB-2Asn Tyr ArgA3Arg TrpB-3Trp His VaiA-4His Vai+肽顺序Ala Phe Gly Lys Asn Tyr Arg Trp His Vai5.二硫键定位蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检 出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别 测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测出的一级 结构比较，就能找出相应的二硫键的位置。用酶直接水解变形的蛋白质：由于二硫键只在偏酸性条件下才稳定存在， （在碱性条件下 易发生交换） ， 因此常用胃蛋白酶水解， 且此酶 专一性低，位点多，生成的肽段中包含二硫键的 比较少