免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点

1、 组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等,有关各种标本的取材方法分述如下。一、动物的致死法及取材(一致死法(1空气栓塞法向动物静脉内注入一定量的空气,使动物很快死亡。一般适用大动物,例如兔、犬、猫等动物。(2麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉,也可用4%戊巴比妥作静脉注射,或用20%氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。(3断头法用剪刀剪去动物的头部,待血液流出后立即取材。适用于小动物。(4去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。(5股动脉放血法动物麻醉后,切开股动脉放血致死。(二取材注意事项(1最好在动物心脏还在跳动时立

2、即取材,并迅速投入环保组织固定液内。脏器的上皮组织易变质,争取在死后半小时内取材完毕,否则免疫组化染色时会产生背景染色。(2切取组织使用的刀、剪要求锋利,避免来回挫动组织。因动物组织质脆,因此夹取组织时切勿用力过重,以免挤压损伤组织。二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行,一般取材部位和数量如下。(1心和大血管右心室一块,左心室一块,主动脉一块,取材部位可在距主动脉瓣5cm处。(2肺右下叶一块,切成正方形;左下叶一块,可切成长方形。(3肝右叶一块,切成正方形;左叶一块,切成长方形。(3脾一块。(4胰一块。(6肾两肾各一块,包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形,左肾一块切成长(7

3、膀胱一块。(8肾上腺左、右各取一块。(9消化道食管一块,胃窦部一块,小肠一块,淋巴结一块,直肠一块。(10骨脊椎骨一块。(11胸腺一块。(12子宫宫颈和宫体数块。(13睾丸或卵巢各一块。(14脑左侧运动区一块,左侧豆状核一块,小脑一块。(15脑下垂体一块,前叶或包括前后叶。如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量,以便彻底检查而作出正确诊断。三、活检标本的取材(一常规活检标本的取材应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限,有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪应锋利,避免挤压组织;组织的切面应平整,组织切忌过大、过

4、厚,否则不仅浪费试剂,而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。(二肾穿刺标本的取材进行穿刺取得组织后,立即用生理盐水或PBS冲洗数次去除血迹,并迅速判断所穿组织是否为肾组织(肾组织应为暗红色。当确定为肾组织后,立即将组织臵于木板上,迅速测量其长度;用解剖显微镜或放大镜进行观察,以区别皮质和髓质,并观察标本是否有肾小球。在解剖显微镜下,肾皮质较淡,皮质区可见一些分布不规则、朦胧的红色小点,此即为肾小球。使用解剖显微镜可帮助区别组织,作出准确的判断,使肾活检可靠。穿刺所取得的标本用手术刀片切开,并迅速固定,一半放人装有光镜固定液的青霉素小瓶内,另一半放人装有电镜固定液的小瓶内,均臵于冰瓶内保存。(

5、三小标本的活检取材小标本常见为宫颈、宫内膜、鼻咽、口腔、喉以及各种内窥镜所取得的组织。它们体积较小,因此取材时要用擦镜纸包起来再进行固定、脱水,特别是由胃镜、肠镜等所取的组织,取材时一定要滴上伊红,以防止丢失。活检组织多用活检钳夹取,常因过度挤压而变形。病灶表面有出血坏死,活检时难于采取到深部组织。因此,活检钳的刀口必须锋利,活检时必须采取主要病灶区,尽量避开坏死区。免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。将组织臵于某些化学试剂中,使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位臵称为固定。而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固,终

6、止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应,防止组织细胞自溶,更重要的是保存组织或细胞内的抗原性,使抗原不失活,不发生弥散。不同的抗原,其抗原稳定性不同,依抗原耐受固定液的程度可分为:不稳定性抗原,如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原,一般以冰冻切片进行免疫组化染色;半稳定性抗原,如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等;较稳定抗原,例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S100、Keratin和部分多肽类激素等,其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。固定剂的种类很多,性能不一,因此固定不同的组织应选择合适的固定剂,特别是标记半稳定抗原时,更要选择合适的固定剂和固定条件。一、固定液的种类较好的固

7、定液应具有强渗透力,能迅速渗入至组织内部;其次不会使组织发生过度收缩变形,并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质;还要使组织达到一定硬度,有较好的折光率。固定液分为简单固定液和混合固定液。因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成,欧美国家已不再使用,基本由环保组织固定液替代。西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成,固定效果明显优于常规甲醛。二、固定的方法1.浸泡法这是最常用的固定法,将取好的组织直接浸泡在固定液中,固定的时间一般在224h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。2.蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。具体方法

8、:在一有盖培养皿内滴人1%一2%锇酸水溶液3滴,将涂片放人其中,固定30s至lmin左右,立即水洗后进行染色。3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。将固定液注入血管,以达到充分的固定。经血管分支到达整个组织或全身(1局部灌注固定固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入,注入速度不要太快,用力均匀,注入量适当,以免胀破肺泡。固定眼球组织可从眼后房注人固定液。固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液,同时切断其静脉使得血液排出。脑组织的固定,必须先麻醉动物,分离颈动脉,注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。(2全身灌注固定较大的动物往往采取输液方法,将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入,将

9、另一侧相应的静脉切开放血。固定液的输入量因动物而异,兔、猫约5001000ml,猴、狗约10002000ml。4.微波固定法近几年来微波固定法一直可见报道。经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点,但必须严格控制微波固定的时间和温度。免疫组化组织细胞的脱水(一概述组织经固定和水洗后,会有大量的水分留在组织中,而水又不能与苯融合,因此必须在透明前脱去组织中的水分。用某些溶剂将组织中的水分臵换出来的过程称为脱水。对于不同的组织应分开脱水,特别是一些易脆的组织(如肝、脾等应严格掌握脱水时间,防止在无水酒精中停留时间过长。对于动物组织,应比人体标本相应缩短脱水时间。脱水应按照

10、从低浓度到高浓度的过程,否则标本直接进入高浓度溶液中极易引起组织的强烈收缩或使组织发生变形,从而影响切片,还会造成免疫组化实验过程中的脱片。(二脱水剂的种类(1乙醇最常用的脱水剂,脱水能力强,并能使组织硬化,与二甲苯能混合。其缺点是在高浓度乙醇,特别是无水乙醇中停留时间长会引起组织收缩、变脆而影响后续的切片。尤其是应用全自动脱水机,因是加压抽真空并加温脱水,在高浓度乙醇中停留时间更不能太长,应经试验摸索出适合自己单位脱水需要的时间,不能盲目从书本上套用脱水时间。脱水时,应从低浓度向高浓度梯度进行。一般是人体组织从?5%乙醇开始,对于小动物、胚胎及柔软的组织可从30%乙醇开始脱水。只有脱水充分,

11、才能在透明剂中透明。若是人工脱水,必须在加盖的容器内进行,尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分,阴雨天更应注意。在透明前最好将组织取出,用滤纸吸干后再透明。(2丙酮脱水作用比乙醇强,但对组织的收缩也大,毒性强,价格高,因此一般不用于常规组织的脱水,主要用于快速脱水及固定兼脱水。此时应注意个人防护,最好在带有抽风功能的装臵中进行,脱水时间13h左右。丙酮还可作为染色后的脱水剂,用于甲基绿派洛宁显示DNA及RNA。(3正丁醇为五色液体,微溶于水,在100ml水中只能溶解8.3g,故脱水能力较弱,但能与水、乙醇及石蜡混合,因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡。它的优点是很少引起组织的收缩及变脆。一般用法

12、为:组织经固定及冲洗后,依次人50%、70%、80%乙醇中脱水,然后人正丁醇,1224h后浸蜡。使用时也应注意防护。(4叔丁醇异丁醇的一种,可与水、乙醇、二甲苯混合,可以单用或与乙醇混合使用,是一种使用较广的脱水剂,它不会使组织收缩或变硬,不必经过透明而直接浸蜡。电镜上为常用的中间脱水剂。(5环己酮沸点为140C,冰点为一40C,密度与水相似,无毒,可与苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂混合,也是石蜡溶剂,可代替纯乙醇脱水后直接浸蜡,组织不会变硬,不需经二甲苯透明。(6松脂醇组织固定后按常规经各浓度乙醇至95%乙醇中,按下列顺序进行脱水和透明处理:浸入等份95%乙醇和松脂醇的混合液中,待组织块下沉后转

13、入下步处理;95%乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h;95%乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h;松脂醇I、中各浸泡1h;松脂醇5份加石蜡1份的混合液中浸泡lh,然后浸蜡包埋。多用于经乙醇或Carnoy液固定的组织。经松脂醇处理的组织收缩较小,发生硬化也少。中性缓冲福尔马林影响HE染色用中性缓冲福尔马林后,细胞核颜色的确不够鲜艳,可在染苏木素前用3%冰醋酸媒染10分钟,会有所改善。免疫组化组织细胞的固定(续三、固定的注意事项1.固定液的量固定组织时,必须有足够的固定液,一般为组织块体积的1015倍。固定用的容器必须足够大,组织材料不要太多,避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。2.固定

14、的组织必须新鲜组织取材后应立即固定,否则,组织易收缩变形,并发生自溶现象。3.组织块的体积4.组织固定后的冲洗组织固定后,因固定液渗到组织中,所以必须彻底冲洗,除去固定液,否则会影响下一步的脱水。特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗,尽可能减少色素沉着。对于混合固定液固定的组织,更要及时冲洗,否则将影响免疫组化切片的质量。四、影响固定的因素1.温度一般固定液固定效果随温度升高而加强,温度一般在-7037之间,?以室温22常用。某些酶的固定要求在37以下进行,而某些病毒的固定则要在低温下进行,如用丙酮在-20一-40之间固定30min最佳。对于临床活检标本,固定时间要求短,实践发现用中性甲醛在4

15、0左右固定23h即可。2.浓度10%中性甲醛、4%多聚甲醛最合适,乙醇最常用浓度为95延。在37或室温固定,适合于许多蛋白质、抗原,并能保持其与抗体的反应能力。70%的乙醇固定能力最强。3.固定时间固定时间要视组织块的大小及固定液的种类、浓度、温度而定。组织块越大,固定时间越长;反之,组织块越小,固定时间越短。固定液的穿透力与浓度成正比,固定的时间与温度成反比。总之,固定的时间应根据条件而定。没有任何一种固定液适合于所有组织的固定,应根据条件选择合适的固定液,可以用多种固定液固定作对比,找到比较切合本单位实际的固定液。免疫组化组织细胞的透明(一组织透明的目的及注意事项组织经某些化学试剂作用后,

16、呈现不同程度的透明状态称为透明。组织透明的目的是便于浸蜡包埋,因为很多脱水剂不能与石蜡混合,必须通过透明剂的作用才能使石蜡浸入组织中,因此透明剂必须既能与脱水剂混合,又能与石蜡混合。如果组织透明不彻底,就会导致浸蜡不良。组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水不良以及透明剂的纯度不够造成的。透明剂的体积应为组织体积的5l0倍,并注意定期更换。应用全自动脱水机、标本量又较大的单位,应争取每星期更换一次透明剂;标本量小、用人工脱水的单位,在脱水结束后,可以将组织块取出,用滤纸吸除组织中多余的脱水剂,再放人透明剂中,并观察组织是否透明而决定是否应更换透明剂。(二常用透明剂的种类(1因透明剂大多有强毒性和

17、刺激,欧美主要国家目前都已改用环保透明剂,逐步禁止使用二甲苯类有毒透明剂。西奈山环保组织透明剂系水果油调配而成,纯天然,无毒有水果香味,透明效果好,正逐渐在各大医院推广使用。(2二甲苯为最常用的透明剂,毒性刺激性大、易挥发,不溶于水,透明力强,易使组织收缩、质脆,故组织在二甲苯中停留时间不能太长,特别是动物组织更应严格掌握透明时间。二甲苯在用于染色后的透明时,组织应先浸于二甲苯和苯酚混合液(3:1后,再进入二甲苯透明。(3甲苯和苯性质与二甲苯相似,但透明速度较慢,对组织的收缩程度小。(4氯仿毒性大、不易使组织变脆,其透明能力较二甲苯差,因此透明时间相对较长,易挥发,多用于大块组织的透明。(5香

18、柏油剧毒、是一种柏树树脂,能溶于乙醇,是乙醇脱水后的良好透明剂,但透明时间长达24h。(6苯甲酸甲酯有毒难溶于水,溶于醚,折光率1.517。经95%乙醇脱水后的组织可直接进入苯甲酸甲酯透明。也可用于火棉胶切片。(7苯胺油有毒、又称安尼林油。微溶于水,能与醇、醚、苯以及其他多种有机溶剂混合,应注意避光保存。免疫组化组织细胞的包埋(一石蜡包埋法石蜡是组织切片技术中应用较广泛的包埋剂,切片石蜡须是经多次过滤后呈半透明状的优质石蜡,熔点为5658C的蜡较适宜。包埋时应注意包埋面必须平整,破碎组织应聚集在一起包埋,并注意一些特殊的包埋面。包埋蜡的温度应与组织块温度接近,过高会烫伤组织,过低使组织和石蜡分

19、离,不利于切片。(二体液包埋法体液标本,如痰液、胃液、尿液、胸腹水等,也可行石蜡包埋。痰液应选用含血液的部分或较为可疑的实体部分,滴上伊红后,用皱纹纸包好,用10%的中性甲苯固定,再经常规脱水、透明、浸蜡并包埋。新鲜的胃液、尿液、胸腹水等体液标本,倒去上层的澄清液体,将下面浑浊的液体放人离心管中,以20003000r/min离心15min,倒去上清液后,以环保组织固定液固定下面的沉淀物,然后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。(三快速石蜡包埋法本法适用于没有冰冻切片设备,进行术中病理诊断的单位,取材时注意应小而且薄。主要过程如下。(1将组织放人环保组织固定液中(2人纯丙酮I,3min。(3人纯丙酮,3

20、min。(4人苯,2min。(5人石蜡,5min。(6快速包埋后切片、染色封固。(四冷冻干燥包埋法冷冻干燥包埋法的基本原理是将新鲜组织低温速冻,再利用真空排除组织内所有水分,使石蜡直接浸入组织内而制成蜡块。其优点是可以保存组织内可溶性物质,防止蛋白质变性和酶失活。基本过程:新鲜组织在液氮中速冻后,真空抽气,以排除组织内的水分,然后将充分干燥的组织用甲醛蒸气固定,再将固定过的组织浸入石蜡内浸蜡,最后石蜡包埋。此法包埋的蜡块可用于免疫荧光和免疫酶标记,也可用于放射自显影及IGSS方法。 为了使石蜡完全取代组织中的透明剂,必须经3次浸蜡,每次时间为1h左右。本实验室蜡的熔点一般为5658C,这种熔点

21、的蜡较适中,经过此种石蜡浸透,包埋后切片顺利,连续性好,展片平整。切片是免疫组化准备工作的最后一步,其切片质量相对于常规组织切片来说要求更高,要切得薄而平整,并注意不可有刀痕。主要有石蜡切片、冰冻切片、塑料包埋切片、碳蜡切片等。在切片前还需对载玻片进行相应的处理。一、载玻片的处理免疫组化染色时间长,特别是双PAP、免疫金银染色等方法,所需时间更长,并要反复洗涤,切片在试剂中长时间浸泡,经多次洗涤,极易造成脱片而影响实验的结果。需采用以下方法处理:载玻片先臵于洗洁液(或洗衣粉溶液中煮沸30min,清水洗干净后放人清洁液中浸泡1224h,漂洗,用蒸馏水清洗后臵于烤箱内干燥,然后涂以切片黏合剂。切片

22、黏合剂的配制方法如下。(1明矾明胶的配制方法明矾、明胶各1g,加入到100ml1%甘油中,加热至70C熔化,并搅拌混合至完全透明状,将切片浸入此液中几分钟,也可以涂在载玻片上,362h后即可使用。(2合成乳胶聚醋酸乙烯乳液的配制方法合成乳胶是一种高分子乳化聚合物,具有高度黏合力,无毒、无臭、无腐蚀性。取合成乳胶10份,加蒸馏水90份,搅拌成10%的使用液备用。载玻片可以浸泡此液中,也可以涂片。浸泡时浓度最好稀一点;用于涂片最好浓度高一点,涂完后在36C中5h后即可使用。(3多聚赖氨酸0.05%多聚赖氨酸(分子质量200kDa水溶液,临用时现配,电吹风吹干即可使用。(4进口切片黏合剂此胶属树脂胶

23、,国外作为木材的黏合剂。涂胶方法同(1,即直接涂片或浸入涂片。一般买回来的黏合剂需10%稀释。(5甲醛明胶1%明胶5mi,2%甲醛5ml,混合即可涂片。(6明胶铬明矾戊二醛黏合剂载玻片在10%Extron中65清洗60min,用热水冲洗60min,双重蒸馏水洗2次,空气干燥,然后浸在0.5%明胶0.05%铬明矾液(注:先将0.5%明胶60C溶解,冷却后加入铬明矾中,40C浸浴lmin,空气干燥,用0。2%戊二醛(PBS配制固定60min,PBS洗后,切片空气干燥,于4C保存。(7白胶多聚赖氨酸混合液取进口切片黏合剂10ml,加10mg多聚赖氨酸混匀,即可用于涂片。二、石蜡切片石蜡切片不仅是常规

24、病理中的重要切片形式,也是免疫组化研究中较常用的切片形式,它能满足免疫组化的连续切片要求。为了便于染色及观察,切片时应注意:连续切片时应按顺序分离及贴片,不应颠倒;贴片时应距载玻片一端至少1cm,一般靠一边,以利于显色安全;用于免疫组织化学染色的蜡温应为5658,切片水温在40左右,应先臵于冷水中,然后再移人热水中,这样可以使切片能顺利展平;切片刀要求快,切片要薄,无刀痕和皱褶,在染色时可减少非特异染色;烤片时要注意,抗原性较强的组织可在60烤38h,抗原较弱的组织可于37恒温箱内过夜;切片如需长期保存,可臵于4或室温下,千万不可脱蜡后4保存,因脱蜡后失去了对抗原决定簇的保护。三、冰冻切片冰冻

25、切片的优点是能较完整地保存抗原性。组织细胞的某些抗原成分,特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片的处理过程中,可不同程度遭受破坏或失去抗原性,而冰冻切片就能最大限度地保护抗原。缺点是在冷冻过程中形态结构可能破坏,抗原易弥散,不能用于常规病检及回顾性研究。如希望保存较长时间和避免抗原弥散,可用环保组织固定液在4度固定5-10min。目前大多采用恒冷箱冰冻切片机,将新鲜组织臵于-25左右的恒冷箱中,待组织完全冷冻后即可连续切片。其注意事项:切片刀要快,并且预先冷冻,恒冷箱的温度一般调至-25左右,不能太低,否则组织表面易出现冰渣;抗卷板的位臵要适中,否则难成片;贴片时动作轻而迅速,否则

26、易出现皱褶;组织从液氮内或-80取出,必须进行温度平衡后才能切成片,切完的组织如下次还用,应用冷冻头在没有完全溶解前取下,密闭后低温保存。切片后,应用电吹风冷风吹干或自然干燥。如在短时间内用,可全部进行固定,固定后,PBS 洗,吹干后低温冰箱内保存。四、碳蜡切片碳蜡切片与石蜡切片相似,碳蜡是水溶性蜡,因此切片时不需用水展片,只需贴在载玻片上,吹干即可。切好片应把碳蜡块密闭保存在干燥器内。另外,碳蜡切片不需脱蜡至水,切片可直接入水进行各种染色。免疫组化石蜡切片的脱蜡石蜡切片脱蜡这个步骤,操作时经常被忽视,其实这是很重要的一个步骤,脱蜡是否完全直接影响后面的抗原抗体结合。常规是切片放在二甲苯中3-

27、5min,两次,必要时可升高温度,尤其是没有使用低熔点石蜡包埋的切片。因为二甲苯毒性比较大,刺激性特别强,需在通风柜中操作,少部分同仁为了尽量缩短接触二甲苯的时间,导致脱蜡不完全。现在国外实验室大多不使用xylene二甲苯这个有毒试剂,而改用环保组织透明液,可在普通实验台上操作,可确保脱蜡完全。很多国外文章漂亮的片子,都是这些细节决定的喔!石蜡切片免疫组化染色步骤1、载玻片的处理:抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常进行,可选用我公司提供的ZLI-9001APES、ZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005Poly-L-Lysine

28、等几种试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下:1.1APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中,停留2030秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,臵通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。1.2HistogripTM:将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中,停留12分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时,装盒备用。1.3Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,

29、60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。2、常用酶消化:2.1胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%0.1%,消化时间为37、1040分钟,主要用于细胞内抗原的显示。2.2胃蛋白酶:一般使用浓度为0.4%,消化时间为37、30180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白,Collagen IV(IV型胶原等。2.3g/ml的saponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。m皂素(Saponin:一般使用浓度为2103、抗原热修复:如果组织固定没有使用甲醛类固定液,使用的是环保组织固定液,如西奈山环保组织固定液,一般情况下,可省去抗原修

30、复过程,因非醛类固定液,不对蛋白形成大量的交联,不会掩盖抗原族。3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液的容器中,臵微波炉内加热使容器内液体温度保持在9298之间并持续1015分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设臵条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求。取出容器,室温冷却1020分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型。PBS洗,下接免疫组化染色步骤。3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500ml3000ml的

31、枸橼酸盐缓冲液(工作液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片臵于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热56分钟后,计时12分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS 洗2分钟×3,下接免疫组化染色步骤。3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液的容器中,并将此容器臵于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达9298起开始计时1520分钟,然后端离电炉,室温冷却2030分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。4、免疫组化染

32、色步骤:(以美国ZYMED公司SP试剂盒为例1石蜡切片脱蜡至水。23%H2O2室温孵育510分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。3蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行。4510%正常山羊血清(PBS稀释封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37孵育12小时或4过夜。5PBS冲洗,5分钟×3次。6滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释,37孵育1030分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37或室温孵育1030分钟。7PBS冲洗,5分钟×3次。8滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS

33、稀释,37孵育1030分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37或室温孵育1030分钟。9PBS冲洗,5分钟×3次。10显色剂显色(DAB或AEC。11自来水充分冲洗,复染,封片。冰冻切片免疫组化染色步骤室温放臵30分钟后,入4丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3。用3%过氧化氢孵育510分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗,5分钟×2免疫组化实验过程中的要点和技巧1.固定:常用4%的多聚甲醛固定液,最好用环保组织固定液,安全,无毒。对于冰冻切片,环保组织固定液有更好的优越性;但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而

34、推荐的固定液,请于购臵前注意说明书。Bouin S固定液:饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的长期保存。PLP液:即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2.组织脱水,透明:时间不能太长,应用新型环保组织透明液,不含二甲苯等有毒试剂,可避免切片时容易碎片,切不完整。3.切片时展片:有些组织在切片后难以在水中展开,这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4.烤片:6030分钟或37过夜,温度太高或时间太长,抗原容易丢失。5

35、.蜡块及切片的保存:最好在4保存6.脱片问题:Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行,可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine的切片。在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法:切片在脱蜡前,放在APES1:50丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步。7.灭活内源性酶:HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活。8.暴露抗原:对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加

36、免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9.封闭:在山羊血清封闭,非特异性染色仍然较强时,可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10.抗体稀释:应遵循“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11.背景高:在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1Tween20的PBS洗,特别是在显色之前要多洗。12.返蓝:在苏木素复染后,可用碱性缓冲液(如PBS或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13.显色:一定要在显微镜下观察

37、,注意控制背景。14.在整个操作过程中,切片千万不能干燥,否则会有非特异性染色。免疫组织化学组织细胞的组织浸蜡组织经过脱水、透明后臵人石蜡中,使组织变硬而利于切片的过程称为浸蜡。 免疫组化操作制度1、设臵单独的实验室。2、必须有专用的冰箱,天平和pH计,并定期校对。3、实验用玻片,器皿必须清洁。经过泡酸处理,清洗干净。4、即用型试剂必须放入4度冰箱内,并每天对冰箱温度进行检查并登记(包括-80度和-20度冰箱。5、试剂在有效期内使用(自己配制的试剂,也需标明有效期,使用前必须核对有效期。6、专用的脱蜡,脱水流程。7、设立阳性和阴性对照。8、根据各种抗体具体要求进行抗原修复。9、新抗体必须摸索出

38、最佳稀释度。10、孵育时间,温度根据各种抗体的具体要求操作。11、DAB显色必须在镜下观察。12、复染后经酒精充分脱水,环保组织透明液透明湿封。13、封片时不得有气泡,不得有树胶外溢。14、标签必须贴于玻片左侧,编号字迹必须清楚。15、制片工作一般应在48小时内完成。16、切片完成后交付医师时必须按照记录当面清点。17、对使用的免疫组化抗体进行克隆号、稀释比、配制时间记录。免疫组化抗原修复选择应用抗原修复技术一般用于经甲醛固定的石蜡切片标本中,经甲醛固定的部分组织细胞在进行免疫组化染色时其敏感性明显降低,其原因(1(1再用甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定族;(2甲醛在保存过程中会形成

39、羧甲基,而封闭抗原决定族;(3在用固定剂固定时,会使蛋白与蛋白之间发生交联,也可能会封闭抗原决定族。因此,在染色时,有些抗原须经修复或暴露即将固定时分子之间所形成的交联破坏而恢复抗原的原有空间形态。因此免疫组化推荐使用不含醛的环保组织固定液常用抗原修复方法:1.柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(1适用范围:适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复,其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。(2仪器设备:普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。(3试剂:0.01M 柠檬酸型缓冲液,pH6.0。(4操作步骤:常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水,待用;(3注意事项:加

40、热时间长短的控制很重要,从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源总时间控制在5-8分钟为好,时间长可能会使染色背景加深。必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架,不能使用铜架,以防缓冲液pH值增高导致组织脱片。高压锅离开火源后必须等缓冲液冷却后,才能把切片取出。为防止组织脱片,玻片必须经清洁处理后,包被0.01%多聚赖氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane。缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丢失。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。2.柠檬酸缓冲液微波抗原修复法(1适用范围:同方法1。(2仪器设备:微波炉、耐高温塑

41、料切片架。(3试剂:0.01M柠檬酸型缓冲液,pH6.0。(4操作步骤:常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水,待用;(3注意事项:微波加热时间长短的控制很重要,从组织切片放入缓冲液到微波结束总时间控制在15-20分钟为好,时间长可能会使染色背景加深。必须使用耐高温塑料切片架,不能使用铜架或不锈钢。微波过程中,如果缓冲液蒸发而量减少,无法浸泡到组织片,应该适当加上一些蒸馏水,以保证组织片都能浸泡在缓冲液中,继续微波。微波结束后,必须等缓冲液冷却后,才能把切片取出。为防止组织脱片,玻片必须经清洁处理后,包被0.01%多聚赖氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopr

42、opyl-triethoxy silane。缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丢失。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。3.柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法(1适用范围:同方法1,效果最差。(2仪器设备:电炉、烧杯(1000ml、不锈钢或耐高温塑料切片架。(3试剂:0.01M柠檬酸型缓冲液,pH6.0。(4操作步骤:常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水,待用;(3注意事项:煮沸时间长短的控制很重要,从组织切片放入缓冲液到烧杯离开电炉总时间控制在20分钟为好,时间长可能会使染色背景加深。必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架,不能使用铜架,以防缓冲液pH值增高导致组织

43、脱片。微波结束后,必须等缓冲液冷却后,才能把切片取出。为防止组织脱片,玻片必须经清洁处理后,包被0.01%多聚赖氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane。缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丢失。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。4.EDTA抗原热修复法水浴法(1适用范围:同方法1。(2仪器设备:铝锅或铁锅、电炉、烧杯(1000ml、不锈钢或耐高温塑料切片架。(3试剂:1mM EDTA抗原修复液pH8.0。(4操作步骤:常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水,待用;取一定量1mM EDTA抗原

44、修复液pH8.0于烧杯中,放入铝锅或铁锅,盖上锅盖进行热煮(注意防止EDTA液从烧杯中倒出直至锅中水沸腾(此时烧杯内的EDTA液不会沸腾;将脱蜡水化后的组织切片臵于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,继续煮沸20分钟,煮好后从锅中取出烧杯冷却至室温,取出切片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS(pH7.2 -7.4冲洗两次,每次3分钟。进行组化的下一步。(3注意事项:微波结束后,必须等缓冲液冷却后,才能把切片取出。为防止组织脱片,玻片必须经清洁处理后,包被0.01%多聚赖氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane。缓冲液的量必须

45、保证所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丢失。用过的EDTA缓冲液不能反复使用。5.酶消化法抗原修复法(常用胰蛋白酶和胃蛋白酶(1适用范围:同方法1,酶消化可以大大增强免疫组化染色效果。胰蛋白酶(trypsin一般为0.05%0.25%,常用0.125%。胃蛋白酶(pepsin常用0.4%。(2操作步骤:常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水,;阻断内源性过氧化物酶(也可以在消化处理后进行阻断,用PBS(pH7.2-7.4冲洗3次,每次3分钟。用吸水纸吸干组织周围的水分,界限笔沿组织外周划圈,再滴加酶消化, 3715-20分钟(注意加酶前保持组织湿润,不能干,加酶后注意不

46、要使液体流出圆圈外,酶消化时间可以根据情况调节,PBS冲洗3分钟×3次,进行组化的下一步。(3注意事项:配好的消化酶溶液至4-8冰箱保存,避免冰冻。免疫组化石蜡切片脱水用乙醇,而冰冻切片为何用蔗糖溶液,需进一步探讨免疫组化组织细胞固定过程常见问题与原因1、问题:组织固定不佳.原因:(1固定的容器过小或标本数量过多。(2组织取材过大、过厚。(3固定时间不足。(4固定液浓度不够或已失效。(5组织漂浮在固定液面(如肺脏,没有达到固定目的。(6固定液用量不足,与组织比例未达到51以上。2、问题:因固定原因引起的染色困难。原因:(1固定液选择不当。(2酸性固定液中固定时间过久。3、问题:组织扭

47、曲变形。原因:(1所取组织过薄。(2胃、肠、胆囊等空腔脏器固定时未用厚纸片敷垫,而使卷曲。(3组织过多而互相挤压变形。由于标本固定不当所出现的问题,虽然有些补救办法,但所有的办法都不能得到满意的结果,而可能导致整个实验失败。最根本的是要细心操作,杜绝上述问题免疫组织化学标记结果判断,除了鉴别肿瘤细胞阳性或阴性显色外,还必须仔细观察肿瘤细胞阳性着色程度、阳性颗粒定位和分布、阳性细胞数量、阳性标记的组织细胞形态学特征、特异性与非特异性染色,注意识别抗体交叉反应和肿瘤异常表达,并结合肿瘤本身固有的形态结构和肿瘤标记物的标记谱系,加以综合分析。因此,免疫组化标记同样具有其形态学特点,若能熟练掌握则有助

48、于正确判断。一、阳性标记色度特征免疫组化标记结果的显色反应与所采用的方法和选择的底物相关。目前国内诊断免疫组化多采用免疫酶方法,通常为辣根过氧化物酶,底物为DAB,故阳性反应为黄色。肿瘤细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,标记方法越敏感,阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为:淡黄色,提示为弱抗原;棕黄色,为中等度抗原;棕黑色,示为强抗原。在结果判断中,后两者较有意义,可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素外,可能与肿瘤在分化过程中轻度异常表达,或某些恶性肿瘤细胞摄取了周围组织抗原之故,若将其作为肿瘤组织学来源的

49、依据应十分谨慎。此外,按其颜色的折光度,表现为暗棕色和亮棕色两种。所谓暗棕色即为灰暗的棕色反应,色质欠鲜艳而发灰,常见于某些神经内分泌肿瘤和神经鞘瘤中神经元特异性烯醇化酶(NSE、S-100蛋白、神经丝蛋白和突触素等,可能与这些肿瘤细胞产生某种化学物质与底物酶或DAB 作用有关。大部分标记呈亮棕色,即结果显示耀眼的棕色反应,色质较鲜艳,如上皮性肿瘤、间叶性肿瘤和淋巴瘤等大部分细胞结构和成分蛋白常为此种表现。二、阳性标记细胞学特征阳性标记细胞学特征是反映抗原在细胞中的定位和分布情况。决定抗原在细胞中的定位除了与肿瘤细胞本身表达部位有关外,还与组织标本固定效果、抗体的特异性和交叉反应相关。组织固定

50、不佳除了会使抗原破坏和丢失外1,可造成抗原移位;抗体特异性差、纯度不够或严重交叉反应。这些都会导致背景染色加重而影响抗原在细胞中的定位。在肿瘤诊断中阳性细胞以拟标记的肿瘤细胞为前提,阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的阳性表达和非肿瘤细胞即使是阳性也不应作为判断依据。根据抗原在肿瘤细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位分为5种类型:(1胞膜型:阳性颗粒主要分布于细胞膜表面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。一般良性肿瘤黄色膜层较完整,厚薄均匀而规则。恶性肿瘤则深浅不一,厚薄不均,部分瘤细胞或细胞膜部分区域缺如。此类型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原(EMA、上皮特异性抗原(ESA、上皮肿

51、瘤相关抗原(结肠癌相关抗原、肿瘤相关粘液抗原、卵巢癌抗原等(2、间皮细胞抗原(HMBE-1、淋巴细胞抗原中白细胞共同抗原(LCA、B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原(GAA、Ki-1等。值得注意的是,某些膜抗原对于不同肿瘤其表达方式有一定差异,判断时应引起注意。(2胞核型:阳性颗粒定位于细胞核。它可以均匀地分布于整个胞核,也可位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布,多见于增殖细胞核抗原(PCNA、PANA、Ki-67、有丝分裂蛋白(MPM,激素受体中雌激素受体(ER、孕激素受体(PR,基因p53等。增殖细胞核抗原和某些癌基因,视肿瘤细胞良恶性和增殖情况,其染色强度和分布形式有异。良性增殖细胞多为淡黄

52、色,颗粒细胞均匀,分布于整个细胞核;而恶性增殖细胞核深浅不一,颗粒粗细不等,部分颗粒聚积呈小块状且分布不均,当然核大小和核形态也显著异型。这些特点同样有助于良恶性肿瘤的判断,尤其对于淋巴瘤和交界性肿瘤的诊断具有重要意义。(3胞浆型:阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型,如细胞角蛋白、前列腺特异性抗原(PSA、前列腺酸性磷酸酶(PSAP、癌胚抗原(CEA、波形蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、1-抗胰糜蛋白酶等中间丝及细胞成分相关蛋白多数位于细胞浆。但同一种标记在不同的肿瘤中的表现形式则有异。依据抗原在胞浆内分布形式,通常表现为弥漫和局限性两种。前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个

53、细胞浆,包括胞体和突起。局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位,核周或细胞浆的一侧等。某些神经内分泌肿瘤表达细胞角蛋白和波形蛋白。某些肌源性肿瘤中结蛋白,脑垂体肿瘤中催乳素(PRL和生长激素(GH常见到这种局限性分布形式。细胞浆阳性颗粒粗细与肿瘤本身类型有关,如恶性组织细胞瘤、恶性黑色素瘤和某些神经内分泌肿瘤等颗粒较粗;上皮肿瘤、肌源性肿瘤及神经鞘瘤等颗粒相对较细。(4微绒毛型:抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛,而胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达。这种表现形式最常见于各种腺癌,如甲状腺癌、乳腺癌、胃肠腺癌、胆道腺癌,卵巢浆液性腺癌等。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外,其余

54、基底部可呈阴性反应。在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠癌相关抗原、肿瘤相关粘液抗原和卵巢癌抗原等。甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现。间皮细胞瘤中HMBE-1也可见微绒毛表达。但恶性肿瘤中并非所有肿瘤细胞都表达,仅见于部分腺体或部分区域的肿瘤细胞。(5复合型:在常规免疫组化标记中,同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆,但很少发现胞膜和胞核同时表达。上皮膜抗原在腺癌中除显示膜阳性外,许多情况下胞浆也呈阳性反应。上皮特异性抗原多数为膜阳性,但在胃肠腺癌、精原细胞瘤等可显示胞浆阳性。这是由于细胞浆内有较多膜系结构,故阳性颗粒可同时定位于细胞膜和胞浆。结肠

55、癌相关抗原在胃肠腺癌、乳腺癌相关抗原在乳腺癌和甲状腺癌、卵巢癌抗原在卵巢浆液性腺癌中,除腔面微绒毛强阳性表达外,有时胞浆也呈阳性反应。某些标记物如GAA 在粒细胞和R-S细胞为膜表达,而胃肠腺癌则为胞浆表达;组织细胞抗原呈组织细胞膜阳性,某些肺癌则见于细胞浆;间皮细胞抗原对于间皮细胞表现为膜阳性,而腺癌虽也阳性,但常见于细胞浆3。另一些抗原分布于细胞浆和细胞核,故细胞核和浆同时阳性。最常见的标记为S-100蛋白、黑色素瘤相关抗原(HMB45。无论是星形细胞瘤、唾液腺肌上皮瘤、还是神经鞘瘤和黑色素瘤等S-100均可同时显示胞浆和胞核阳性。HMB45在恶性黑色素瘤中亦是如此。有时PCNA在部分Ho

56、dgkin病和个别胃肠腺癌胞浆可呈弱阳性反应,雌激素调节蛋白在乳腺癌可同时定位于胞浆和胞核。此外,组织标本固定不及时造成抗原移位,或乳腺癌中ER和PR修复不充分也可以发生核和浆同时阳性三、阳性标记组织学特征肿瘤免疫组化标记的组织学特点与下列因素相关:(1肿瘤自身组织学结构,如上皮性肿瘤阳性细胞常呈团块状和腺管状,淋巴瘤多为弥漫性结构;(2肿瘤细胞分化程度,免疫组化结构有时与HE结构并非完全一致,如低分化肿瘤可表现为不规则斑片状或局灶性阳性;(3肿瘤细胞抗原表达的特定部位情况,如LCA、B细胞、T细胞等膜抗原在淋巴瘤中常表现为网状结构。根据肿瘤免疫组化阳性细胞的组织学特点表现为局灶型、弥漫型、片

57、块型、网状型、腺管状型和菊团型等。1.局灶型:阳性瘤细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞可多可少,排列不规则,无固定排列形式,阳性染色深浅不一。这是因为肿瘤细胞分化的不一致性之故。细胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鳞状细胞癌、腺癌和癌肉瘤;肌动蛋白(MSA和结蛋白在低分化横纹肌肉瘤; NSE、神经丝蛋白、突触素在恶性神经内分泌肿瘤,低分化星形胶质细胞瘤中胶质纤维酸性蛋白,恶性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表现为局灶性阳性。此种情况若发生在细胞结构蛋白和细胞成分蛋白则提示该肿瘤分化程度较低。某些恶性肿瘤细胞异常表达或向某一组织细胞分化也常表现为局灶性阳性,如胃肠腺癌的神经内分泌表达,平滑肌和神经鞘瘤向上皮分化等。2.弥漫型:阳性细胞呈弥漫性分布,细胞间无连接,也可以单个细胞散在分布。淋巴造血肿瘤中Hodgkin病、部分淋巴瘤和组织细胞瘤常弥漫性分布;上皮性肿瘤中胃肠未分化癌也表现为弥漫性,但有时可见条索状结构;神经内分泌肿瘤中分化较好的肿瘤细胞可见弥漫性结构。因此,弥漫性结构常见于小圆细胞肿瘤,而且这些肿瘤细胞几乎都高度表达某种抗原,如淋巴瘤(LCA、B细胞、T细胞,Hodgkin病(粒细胞相关抗原、Ki-1,胃肠未分化癌癌胚抗原(CEA、上皮膜